蛋白质组双向电泳原理及实验步骤课件解析.pptVIP

蛋白质组（Proteome）： 在一种细胞内存在的全部蛋白质。 蛋白质组研究中主要应用的技术包括： 双向电泳(2-DE)、 新型质谱(MS)技术、 数据库设置与检索系统等。 双向电泳实验流程 样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS电泳（SDSelectrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） PDQuest软件分析（Software analysis） 质谱鉴定（Protein identification） 样品制备基本原则： 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 双向电泳样品的溶解 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。 溶解的手段： 离液剂、去垢剂、还原剂、两性载体电解质 聚焦时间的优化 要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。 聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。 两维间的平衡 等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－80°保存数月。 但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS电泳能顺利进行。 二维SDS同普通SDS类似。 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。 双向电泳实验流程 样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS电泳（SDSelectrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） PDQuest软件分析（Software analysis） 质谱鉴定（Protein identification） 等电聚焦程序的设置 7cm胶条 水化 12小时（17℃） 被动水化 S1 250V 慢速 30分钟 除盐 S2 1000V 快速 60分钟 除盐 S3 4000V 线性 3小时 升压 S4 4000V 快速 24,000伏小时 聚焦 ~28,000伏小时 S5 500V 快速 任意时间 保持 l???选择所放置的胶条数。 l???设置每根胶条的极限电流。（30-50?A/根） l???设置等电聚焦时的温度。（17℃） 配制SDS凝胶 配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。聚合30分钟。 待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。 胶条的平衡 冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 配制胶条平衡缓冲液 I 。 吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。 第二次平衡 ，振荡15分钟。 吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。 琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。 SDS电泳 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/7cm），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。 考马斯亮兰染色 Bio-Safe染色 水洗3次，5min/次。 Bio-Safe染色1小时。 水洗30min. 双向电泳技术在病原微生物蛋