色谱技术实验2011.docVIP

色谱技术实验 实验一 中药提取液HPLC梯度洗脱条件的优化………………………… 实验二 中药挥发油GC程序升温分析条件的优化…………………………… 实验三 气相色谱-质谱分析（GC-MS） …………………………………… 实验四 混合染料TLC分离条件的三角形优化………………………………… 实验一 中药提取液HPLC梯度洗脱条件的优化 一、目的 1．掌握高效液相色谱分析中，梯度洗脱条件的决定因素。 2．熟悉HPLC梯度洗脱条件优化的思路。 二、提要 对于成分复杂的中药提取液，测定其HPLC指纹图谱一般采用梯度洗脱的方法。而梯度洗脱条件主要受梯度范围（梯度起始浓度和终止浓度）、梯度斜度及强溶剂种类的影响。其中梯度范围和梯度斜度决定流动相的洗脱强度，可以通过调整梯度范围和梯度斜度，使样品组分的k’值符合1＜k’＜20范围；而强溶剂的种类决定流动相的选择性。本实验主要考察不同洗脱系统的溶剂强度对于梯度分离条件的影响。 三、实验条件 1．高效液相色谱仪； 2．ODS柱（C18, 4.6mm×150mm, 5μm或4.6mm×250mm, 5μm）； 3．流动相：甲醇－水；流速：1ml/min。 4．检测器：DAD检测器，检测波长270nm。 5．样品：中药提取液。 四、操作步骤 1．以甲醇—水（5:95），30min至甲醇（100%），保持10min，观察样品分离效果。 2．根据分离结果，调整梯度范围和斜度，即调整甲醇的起始浓度和终止浓度，及浓度变化速率，使中药提取液各主要组分的K’分布范围在1～20之间。观察各组分的分离度。 3．分析实验结果，观察流动相起始浓度、终止浓度及浓度变化速率对各组分保留时间及分离度的影响。 五、思考题 1．梯度洗脱中，如果色谱峰集中在整个分析时间的中间段，即在洗脱的开始和结束的时间里没有组分出现，应如何调整梯度范围？ 实验二 中药挥发油气相色谱分析条件的选择 一、目的 １．练习气相色谱仪的使用，了解气相色谱仪的基本结构。 ２．掌握柱温的变化对组分保留时间及分离度的影响。 ３．掌握程序升温对复杂样品分离度及分析时间的影响。 二、提要 对于宽沸程的样品分析，采用程序升温（单阶程序升温、多阶程序升温），在分析过程中柱温随时间而变化，通常是升高柱温。它的优点是减少分析时间。程序升温条件选择是确定初始温度、初始时间、升温速率、终止温度、终止时间。 三、仪器与试剂 （1）气相色谱仪（FID检测器）； （2）微量注射器（1μl）； （3）样品：中药挥发油-干姜挥发油 四、操作步骤 １．设置实验条件：色谱柱：甲基苯基交联硅烷柱(30m×0.32mm, 0.52μm)；检测室300℃，气化室250℃；载气流量：N2 1.2ml/min；分流比30 : 1。 程序升温条件（初始试验条件）：50℃，以15℃/min升温至250℃，保持5min。 2．根据试验结果，调整初始温度、终止温度以及升温速率，可根据需要设置阶梯形程序升温分离。 五、思考题 程序升温的初始温度、终止温度及升温速率的对分离度会有什么影响？ 实验三 气相色谱-质谱分析（GC-MS） 一、目的 1．练习气相色谱-质谱仪的操作，熟悉气质工作站的使用。 2．掌握SCAN及SIM的应用。 二、提要 气质联用技术是在气相色谱分离的基础上，利用质谱作检测器（ＭＳＤ），可以得到不同时刻的质谱信息，灵敏度高，选择性好，给定性、定量分析带来方便。在气质联用中，质谱检测器采集数据有两种模式：ＳＣＡＮ（全扫描）和ＳＩＭ（选择离子监测），其中SCAN连续扫描采集选定质荷比范围内所有离子的信号，可以获得化合物的质谱图，通过自动检索能够得到化合物的结构，常用于定性分析，峰形及灵敏度稍差，而SIM只监测采集某几个所选的特征离子的信号，灵敏度高，峰形好，主要用于定量分析。 本实验首先对样品作SCAN分析，以获得个化合物的质谱图，通过检索进行定性分析，并选择每个化合物的特征离子（一般选丰度较高的），利用所选的特征离子作SIM分析，并比较SCAN和SIM的异同。 三、试剂与仪器 （1）气相色谱-质谱仪（MS检测器）； （2）微量注射器； （3）质谱工作站； （4）样品溶液：混合溶剂 四、操作步骤 1．实验条件： 色谱参数：进样口250℃，分流进样，分流比30:1，色谱柱：甲基苯基硅烷柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气流量：1.2ml/min（He），接口温度280℃，柱温：60℃，保持1min，15℃/min，升到200℃，保持1min。 质谱参数：溶剂延迟1min，SCAN：30-400质量数，SIM：自选参数 进样量：0.1 μl 2. 仪器稳定后作自动调谐； 3. 调谐完成后，分别用SCAN及SIM采集样品的色谱图，通过气质工作站检索各色谱峰可能的结构，讨