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基 因 克 隆 载 体 生物与食品工程学院 动物基因克隆载体 SV40 (猿猴空泡病病毒) 逆转录病毒 腺病毒 痘苗病毒 杆状病毒 SV40 克隆载体 双链闭环DNA分子 5243bp 早期转录： 逆时针 t抗原 晚期转录 ： 顺时针 壳蛋白 SV40 病毒的增殖 DNA进入细胞核 启动早起转录，t/T抗原积累 DNA复制，晚期转录 - 翻译外壳蛋白 包装，累积数量 裂解感染 细胞裂解，释放病毒颗粒 非裂解感染 插入染色体DNA，导致癌变 SV40 载体构建 SV40 对包装的要求极为严格，不能包装大于SV40-DNA的DNA分子。 取代型质粒载体 早起取代 建立具有t/T抗原的辅助病毒载体 建立具有SV40病毒早期转录区DNA的辅助细胞系 晚期取代 缺失外壳蛋白，需与辅助病毒载体一起转染受体细胞。 逆转录病毒载体 一类RNA病毒，病毒RNA逆转录成双链DNA，然后整合到染色体DNA上成为原病毒，随染色体DNA进行复制转录和翻译。 劳斯肉瘤病毒 逆转录病毒载体 劳斯肉瘤病毒生物学特征 以正链RNA为模板，合成负链DNA，在RNase的作用下，单链RNA链被降解，然后合成双链DNA。 双链DNA分子可以整合到宿主细胞的染色体上形成原病毒。 原病毒DNA可以转录成RNA，用于包装成病毒，或合成相关蛋白。 逆转录病毒构建载体的策略 RNA不能直接用于构建基因载体，必须首先从被感染的动物细胞中分离得到原病毒DNA，删除非必须区，组入选择标记基因，目的基因和一些调控原件。 将修改后的原病毒DNA与质粒载体相连，形成逆转录病毒－质粒载体。 逆转录病毒－质粒载体 载体在大肠杆菌中进行多拷贝 提取大肠杆菌中的载体 DNA，并转化动物细胞。 转化的动物细胞可以转录出重组的逆转录病毒RNA （不能包装） 辅助逆转录病毒－合成包装颗粒 构建可以合成病毒包装所需蛋白的宿主细胞 新包装的逆转录病毒可以去感染宿主细胞 逆转录病毒－质粒载体 优点： 转化效率高 每个基因组中一般只有一个拷贝，避免多插入引起的麻烦。 缺点： 辅助逆转录病毒是致病的，有一定的风险。 同源重组构建载体 同源重组是指发生在姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化。 同源重组构建载体 构建具有一部分与受 DNA 相同的（同源）DNA的转移载体，然后将目的基因插入到转移载体同源顺序中间，使其两侧具有与受体 DNA 同源的顺序 腺病毒基因载体 二十面体病毒 感染人、猴、牛等哺乳类及禽类 线性双链DNA分子，35kb左右，当DNA从病毒颗粒释放出来时，可以自行环化。 两端具有反向重复序列 腺病毒基因载体 1. 构建含有病毒基因组序列的质粒载体（包含外源基因、多克隆位点、筛选标记基因），穿梭质粒。 2. 缺失非必须基因的环状腺病毒DNA质粒 3. 将 1 和 2 共同转染包装细胞，通过同源重组，便可获得重组腺病毒。 腺病毒基因载体的应用 1. 将抑癌基因导入癌细胞中（p35/p16）。 2. 导入前体药物转换酶基因。 3. 导入核酶基因 (通过核酶抑制癌基因的过量表达) 痘苗病毒基因载体 线性双链DNA分子，两端为倒置重复序列 增殖在哺乳动物细胞质中进行，20h完成一个周期。 TK（胸苷激酶）基因：属于致病基因，在DNA复制中必须 HA（ 血 凝 素 ）基因：促使病毒吸附细胞 痘苗病毒基因载体 目的基因两端组装TK基因或HA基因的片段 通过目的基因两端的TK或HA基因片段与痘苗病毒的TH基因或HA基因同源重组，将目的基因整合到痘苗病毒基因组上。 杆状病毒载体 一类双链闭合环状DNA病毒，基因组为88160kb 专一寄生无脊椎动物，主要是昆虫 致病性安全性都很稳定，有很好的应用前景。 Thank you !