第3章载体要点分析.pptVIP

转录终止子：基因编码区下游一段使转录终止的核苷酸序列。 SD序列：原核生物结构基因起始密码子上游与核糖体30S亚基识别和 结合的位点，称为核糖体结合序列即SD序列。 （2）表达方式包括组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达。 组成型表达：持续不断地表达目的蛋白。 诱导型表达：在诱导物存在的情况下表达目的蛋白。 融合型表达：表达载体的多克隆位点上有一个融合表达表达标签， 表达的蛋白为融合蛋白。 分泌型表达：在起始密码和目的基因之间加入一个信号肽，可以引导目的 蛋白穿越细胞膜，分泌到细胞外。。 （二） 酵母表达载体 （三） Ti质粒表达载体 1.天然Ti质粒的结构及其致瘤功能 Ti （tumor inducing plasmid）质粒是根癌农杆菌中可引发植物产生冠瘿瘤的致瘤； 大小为200-250kb； Ti 质粒可分为4个功能区：T-DNA、Vir、Con、Ori T-DNA区：Ti质粒中能够转移到植物细胞内的区域，称为T-DNA 即 transfer DNA 2. Ti质粒表达载体 一元载体：指含目的基因的中间表达载体和改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。 双元载体：指由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。 双元载体的特点： a.大肠杆菌和农杆菌穿梭载体； b.可用基因枪或农杆菌介导进行遗传转化； c.转化效率高于一元转化载体。 * * 第三章 载体 载体：能够携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、 整合或表达的工具称为载体（Vector） 克隆载体 表达载体 第一节 克隆载体 克隆载体：用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体 克隆载体必备条件： ① 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞； ② 能在宿主细胞中自主复制，或整合到宿主基因组中随其一起复 制， 实现外源基因的增殖； ③ 具有由单一限制性内切酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因 插入； ④ 具有合适的选择标记，用于含有重组载体的宿主细胞筛选。 用于基因克隆的载体的类型： 质粒载体（plasmid vector） 噬菌体载体（phage vector） 考斯质粒（cosmid vector） 人造染色体载体（artificial chromosome） 一、质粒载体 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子； 质粒常见于原核细菌和真菌中； 绝大多数的质粒是DNA型的； 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA； 质粒的分子范围：1-200kb。 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得 寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物； 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱。 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。 (一) 质粒的基本性状 1. 复制 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统自主复制； 根据寄主每个细胞内分子数（拷贝数）多少，质粒可分为两大复制类型： 严谨型：1-9拷贝 松弛型：10个以上 2. 质粒的不相容性 定义：指两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。 通常含有相同或相似复制子的质粒具有不相容性。 3. 质粒的转移性 接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F质粒等； 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。 用于构建基因克隆载体的质粒一般是非接合质粒。 （二）质粒载体的构建 天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造： （1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点 （MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。 （三）常用的质粒载体 1. pBR322质粒载体 2. pUC18和pUC19质粒载体 3. TA载体 二、噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质 外壳蛋白 λ噬菌体 线性，全长48502bp λDNA 5’端含12bp的黏性末端 （一） λ