RNA提取和Northern blot.docVIP

模块二 总RNA的提取与Northern杂交 核酸是生物遗传的物质基础，决定生物体的遗传、变异、生长和发育。在基因工程中，核酸分子是主要的研究对象，因此核酸的分离、提取是分子生物学研究中很重要的技术。RNA是用来在转录水平上研究基因的表达与调控机制的载体，它是基因操作的重要对象，纯度高、浓度高、完整性好的RNA为基因的下游操作可以提供良好的保证，RNA的提取是基因工程操作中最常用、最基本的实验技术。 -2.0倍，且这两条带都没有弥散现象。mRNA是不可见的，除非过量上样。 3. 实验设备 移液器，tip头， tip头盒、台式高速离心机，研钵，1.5ml离心管 ，三角瓶，磁力搅拌器，试剂瓶，-80℃冰箱，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶 4. 实验试剂 RNA提取液： 0.8mol/L盐酸胍，0.4mol/L硫氢酸铵，0.1mol/L醋酸钠（pH5.0），5%甘油，38%Tris-饱和酚。 10×MOPS（，2-(N-morpholino )propane sulfonic acid）：0.2mol/LMOPS，50mmol/L，10mmol/LEDTA。 RNA：62.5% 去离子，16% 10×MOPS，22% 电泳缓冲液：用无菌水稀释10×MOPS，使终浓度为1×MOPS。 其他试剂：琼脂糖，1mg/ml溴乙锭，溴酚蓝，甲醛，β-巯基乙醇，氯仿，异戊醇，75%乙醇，1.2MNaCl，异丙醇，灭菌的ddH2O。 （1）1.5ml Eppendorf管中加入1ml RNA抽提液、30μl β-巯基乙醇。 （2）（3）（4）（5）（6）（7）试剂 用量 琼脂糖(0.8%) 0.16 g 10×MOPS 4.8 ml 水 15.2ml -1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中（注意不要出现气泡），凝胶厚度在3-5 mm之间。 （11）RNA样品变性：在1.5ml灭菌离心管中加入3.2 (l上样缓冲液，1.3 (lRNA样品，混合震荡，使之充分混匀，手掌离心机离心10s。65℃金属浴5 min ，冰上冷却后，手掌离心机离心10s。 （12）在凝胶完全凝固后（室温下30-40 min），撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×MOPS的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1 mm。电泳槽中的缓冲液最好与制胶所用的缓冲液是同一批次的，若两种缓冲液中的离子强度及pH不一致，将影响核酸的迁移率。 （13）点样：将冷却的变性RNA样品与1 (l溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加入上样孔中。 （14）盖上电泳槽并通电，使RNA向阳极（红线）移动。采用65V电压进行电泳。小电泳槽V=50-65v；中电泳槽V=100v；大电泳槽V=150v。 （15）当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。 6. 作业 （1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤。 （2）7. RNA制备中的关键因素 RNA酶的特点： （1）存在广泛：尘土、实验器皿、试剂、汗液及唾液当中均有RNA酶（RNase）存在。 （2）活性稳定：耐热、耐酸碱，用水煮沸都不能使其失活，蛋白质变性剂可使之暂时失活，一旦去除变性剂后RNase会恢复其活性。 （3）其发挥活性不需辅助因子：二价离子整合剂不能抑制其活性。 创造无RNase的环境： （1）RNA酶。 （3）玻璃器皿的处理：用水清洗干净后，200℃干烤4小时。 （4）（5）RNAH2O2溶液中10分钟后，用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗。 （6）RNase活性：尽量在冰浴中操作。 去除内源RNase的污染： （1）在细胞破碎的同时，RNase也被释放出来，原则上应尽可能早地去除细胞内蛋白并加入RNase抑制剂。 （2）RNase为一种蛋白质，故去除蛋白质的试剂可非特异地抑制RNase的活性。如酚、氯仿，其作用是使蛋白质与核酸解离，同时作为蛋白质变性剂，可以抑制RNase的活性；并且酚与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制；蛋白酶K，与1%~2%的SDS合用其效果更佳；阴离子去污剂，常用的有SDS、十二烷基肌氨酸钠等，可以解聚核酸与蛋白质的结合，并且与蛋白质带正电荷的侧链结合，在高盐存在下形成SDS-蛋白质复合物而沉淀。 （3）解偶剂（胍类）：盐酸胍、异硫氰酸胍。目前认为，异硫氰酸胍是一种RNase最有效的抑制剂。制备RNA时，如果缓冲液中含有异硫氰酸胍，则可在破碎细胞的同时也使RNase失活。异硫氰酸胍有破坏细胞结构、使核酸从核蛋白中解离出来，并对RNase有强烈的变性作用。异硫氰酸胍与β-巯基乙醇（破坏蛋白质的二硫键）合用，使RNase被极度抑制。 （4）低特异性的RNas