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青蒿素生物合成 10生物技术（2）班 曾庆辉 201024112211 青蒿素是我国科研人员从传统中医药黄花蒿中提取出来并自主研发的一种抗疟疾特效药[1]。20世纪70年代，我国科技工作者从黄花蒿中分离提纯出一种抗疟活性单体——青蒿素，以后又确定了它的分子结构和构型。1986年我国自主研发的蒿甲醚油针剂、青蒿琥酯钠盐的水针剂以及青蒿素栓剂等抗疟疾药作为一类新药在我国批准生产。1995年蒿甲醚率先被收入国际药典，这是我国首次得到国际认可的自主研发新药。目前，青蒿素系列抗疟药已有5种新药(青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素、复方蒿甲醚)共9种剂型上市并在世界各国销售，每年挽救了数百万重症疟疾患者的生命。除了独特的抗疟作用外，青蒿素系列药物还具有抗血吸虫、肺吸虫、红斑狼疮、皮炎以及免疫调节，抗流感等多种疗效[2]。但是，目前国际抗疟药市场上青蒿素类药物只占有很少的份额，其原因主要在于青蒿素原料缺乏。由此，有研究者另辟蹊径，设想通过生物合成青蒿素。时至今日，青蒿素的生物合成已经取得一定进展，介绍如下： 早在20世纪80年代，中国科学院上海有机化学研究所汪猷院士领导的研究小组就利用放射性同位素标记的2-14C-青蒿酸与青蒿匀浆(无细胞系统)保温法证明，青蒿酸和青蒿B 是青蒿素的共同前体[3]。青蒿素生物合成途径仅见于青蒿，但其“上游”途径为真核生物所共有，可望通过“下游”途径重建，在真核微生物(如酵母)中全合成青蒿素。过去10年来，青蒿素合成基因被国内外研究团队陆续克隆并导入酿酒酵母细胞，已成功合成青蒿酸及双氢青蒿酸等青蒿素前体。由于酵母缺乏适宜的细胞环境，尚不能将青蒿素前体转变成青蒿素。因此，青蒿依然是青蒿素的唯一来源，凸显出继续开展青蒿种质遗传改良的必要性。同时，青蒿素生物合成的限速步骤尤其是终端反应机制已基本得到阐明，有助于开展青蒿素形成与积累的环境模拟及仿生，从而为彻底缓解青蒿素的供求矛盾创造先机[4]。若以双氢青蒿酸为青蒿素的直接前体，则青蒿素生物合成过程如下：首先是从乙酰辅酶A经异戊烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、法呢基焦磷酸到紫穗槐-4,11-二烯的合成途径，其中DMAPP与IPP受IPP异构酶(IPPI)催化发生互变，二者再被法呢基焦磷酸合成酶(FDS)作用生成法呢基焦磷酸，并在紫穗槐二烯合酶(ADS)催化下闭环产生紫穗槐-4,11-二烯；其次是从紫穗槐-4,11-二烯到双氢青蒿酸的合成途径，紫穗槐-4,11-二烯在细胞色素P450单加氧酶(CYP71AV1)催化下，经连续氧化依次生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，其中青蒿醛受青蒿醛双键还原酶2(DBR2)催化而还原成双氢青蒿醛，后者再在青蒿醛脱氢酶1(ALDH1)催化下氧化成双氢青蒿酸。双氢青蒿醇转变成双氢青蒿醛由ALDH1/CYP71AV1催化，其逆反应则由双氢青蒿酸还原酶1(RED1)催化，最后是从双氢青蒿酸到青蒿素的合成途径，双氢青蒿酸经过未知的多个非酶促反应最终生成青蒿素。此外，青蒿酸可能经多步反应合成青蒿素B后再转变成青蒿素[5]。 青蒿素的生物合成主要任务有：①青蒿素前体合成工程菌的构建。在这里为了便于叙述，将上述青蒿素生物合成过程分为“上游”、“中游”和“下游”三个途径，分别是从乙酰辅酶A到法呢基焦磷酸的“上游”途径、从法呢基焦磷酸到双氢青蒿酸的“中游”途径和从双氢青蒿酸到青蒿素的“下游”途径。青蒿及其他高等植物与酵母等真核微生物合成法呢基焦磷酸的酶促反应完全相同(循甲羟戊酸途径)，因而只需在酵母中额外增加一个青蒿素合成代谢支路，就能让酵母全合成青蒿素。目前，中游途径的酶促反应已通过导入青蒿ADS，CYP71AV1，CPR，DBR2和ALDH1等基因至酵母而得以完全重建，但下游途径的反应条件在酵母中则尚未建立。回溯到2003年，美国Keasling小组将青蒿ADS基因经密码子优化后导入大肠杆菌中表达，同时用酵母萜类合成途径代替大肠杆菌萜类合成途径，首次在细菌体内合成出青蒿素的第一个关键前体——紫穗槐-4,11-二烯，在6L发酵罐中培养60 h的产率达到450 mg/L[6]。2006年，他们将ADS基因连同CYP71AV1和CPR基因同时导入酿酒酵母中表达，培育出世界上第一株生产青蒿酸的酵母工程菌，经代谢途径修饰与优化，其产率已达153 mg/L[7]。加拿大Covello小组于2008年将新克隆的青蒿DBR2基因连同ADS，CYP71AV1和CPR基因一同导入酿酒酵母，率先培育出合成双氢青蒿酸的酵母工程菌，其中双氢青蒿酸产率为15.7 mg/L，青蒿酸产率11.8 mg/L[8]。中国医学科学院及北京协和医科大学药物研究所的程克棣小组将青蒿 ADS 基因按酵母偏爱密码子优化并导入酿酒酵母后，也培育出产紫穗