高级生化的研究技术(实验).pptVIP

实验三 PCR法克隆植物基因组DNA目的基因 ㈠ DNA抽提的基本原理 先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基磺酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核中心的核蛋白，并与蛋白质形成混合物；再加入酚和氯仿等变性剂，使蛋白变性，经离心除去植物的组织和变性蛋白；上清液中加入无水乙醇或异丙醇使DNA沉淀下来。 ㈡ 琼脂糖凝胶电泳 分离和纯化DNA片段的最常用技术。一块琼脂糖凝胶即为一个包含电解质的多孔支持介质，当把它置于电场中时，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧有富含负电荷的磷酸根残基。DNA分子电泳过程中，有电荷效应和分子筛效应，琼脂糖电泳法分离主要利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。该过程可以通过示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测，分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。 三、实验材料与试剂 ㈠ 材料：水稻叶/根 ㈡ 试剂 ⑴ DNA抽提液：100mM Tris-HCI（pH 7.8），500mM NaCl，25mM EDTA，1％SDS； ⑵ 10×TBE：Tris 108g/L ，硼酸 55g/L，20mmol/L EDTA (pH8.0) ⑶ TE：10mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA； ⑷ 3M NaAc（pH 5.2）； ⑸ Taq DNA聚合酶（含10×PCR buffer） ⑹ dNTP ⑺ 氯仿：异戊醇（24：1）；异丙醇、无水乙醇、70％乙醇等。 ㈢ 仪器设备 PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、恒温水浴箱、水平电泳槽、移液枪等。 四、实验步骤 ㈠ 植物组织微量基因组DNA的抽提 ⑴ 取材料约200mg，放入预冷的研钵中，加入适量液氮，将叶片研磨至粉末状。迅速转到1.5mL 离心管。 ⑵ 加入1mL的DNA抽提液，上下倒转使之混匀，65℃水浴保温30min。12,000rpm离心10min，将上清液转移到另一离心管中。 ⑶ 加等量的氯仿：异戊醇（24：1），室温上下温和混匀约5min。12，000rpm离心10min，将上清液转移到另一离心管中。 ⑷ 加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。12,000rpm离心10min，倒去上清液。 ⑸ 500μL 70％乙醇洗涤2次，风干。用30μL 无菌水溶解，置于-20℃备用。 ⑴ 取材料约100mg，放入预冷的研钵中，加入适量液氮，将叶片研磨至粉末状。迅速转到1.5mL 离心管。 ⑵ 迅速加入700ul 65℃预热的缓冲液GP1，混匀， 65℃水浴20min。 ⑶ 加入700ul 氯仿，充分混匀，10,000rpm离心10min。 ⑷ 取上清至一新离心管，加入700ul 缓冲液GP2，充分混匀。 ⑸ 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，10,000rpm离心2min，弃废液。 ⑹ 向吸附柱CB3加入500ul 缓冲液GD，10,000rpm离心1min，弃废液。 ⑺ 向吸附柱CB3加入700ul 漂洗液PW，10,000rpm离心1min，弃废液。 ⑻ 向吸附柱CB3加入500ul 漂洗液PW，10,000rpm离心2min，弃废液。 ⑼ 10,000rpm离心2min，弃废液，开盖室温放置2min。 (10) 将吸附柱CB3转入一个干净离心管，向膜中间悬空滴加50ul 洗脱缓冲液TE，室温放置2min， 10,000rpm离心2min，收集溶液。 ㈡ PCR法扩增目的基因 以水稻DNA为模板，分别以PSK-F和PSK-R为上下游引物扩增水稻osPSK基因。 ⑴ 反应体系 在PCR管中依次加入下列试剂： 10×PCR反应缓冲液 2 μl dNTP Mixture（2.5mM） 1.6 μl 上游引物（5mM） 2 μl 下游引物（5mM） 2 μl 模板DNA（约10ng） 2 μl Taq 酶（5 U/ μl） 0.2 μl 加无菌水补充至总体积为20 μl 。 ㈢ DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 ⑴ 制胶：称取琼脂糖0.4g，加入1×TBE 50mL，于微波炉中加热至完全溶解。冷却到约60℃，在凝胶中加入2?L的EB（或替代染料），混匀，倒胶。待胶完全凝固后拔去梳子，转移到装有1×TBE的电泳槽。 ⑵ 电泳：取6?L DNA样品，加入1?L loading buffer，用枪头混匀并点样。开始电泳，电压为4~5V/cm，电泳约30min。 ⑶ 观测：把电泳好的琼脂糖凝胶