基因定点突变技术资料.ppt

α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子二级结构的预测 按照Geourjon介绍的SOPMA法，在EXPASY服务器(http: //www. expasy. org/tools)进行预测α毒素和α毒素D56G突变体蛋白分子的二级结构。 α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子3D结构的预测 以蛋白质结构数据库(PDB)解析的A型魏氏梭菌α毒素的三维结晶结构(3D)为模板，利用EXPASY服务器(http : / / www. expasy. org /swissmod /SWISS一MODEL. html)同源模型构建α毒素和α毒素D56G突变体蛋白分子的3D结构，并用Rasmol分析软件绘制其3D结构图。 α毒素及α毒素D56G突变体蛋白圆二色光谱分析 采用J810 -150S型圆二色((CD)光谱仪，在25℃恒温下，将0. 6 mL蛋白溶液(10μmol/L)置于光径为0. 1 cm比色杯中，扫描范围190 ~ 250nm，狭缝宽度1 nm，扫描速度50 nm/min，响应时间2s，扫描次数3次。测定α毒素和α毒素D56G突变体蛋白的CD光谱并记录数据。 重组菌株BL21 (DE3) (pM一D56G)生物学活性的测定 抗原制备及免疫攻毒试验 结果与分析 α毒素D56G突变基因的扩增与表达质粒pM -D56 G的构建 经酶切鉴定和序列测定，结果表明，构建的重组表达质粒pM -D56G含有α毒素D56G突变体基因，而且编码α毒素第56位Asp的密码子GAT己经突变成编码Gly的密码子GGT α毒素D56 G突变体基因表达产物的SDS 分析 含A型魏氏梭菌α毒素D56G突变体基因的重组菌株BL21 (DE3) (pM-D56 G)用IPTG诱导4 h后，SDS分析结果表明，α毒素D56G突变体基因在受体菌BL21 ( DE3 )中得到较高水平的表达。经凝胶成像系统扫描分析，重组菌株BL21 ( DE3 ) ( pM-D56G)中的α毒素D56G突变体蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的22. 48 %。 α毒素及α毒素 D56G突变体蛋白分子二级结构预测 毒素和α毒素D56 G突变体蛋白分子二级结构预测的结果显示，α毒素蛋白含。螺旋118个(31.9%)、β折叠78个(21.1%) β转角44个(11.9%)、无规则卷曲130个(35.1%)，α毒素D56 G突变体含α螺旋118个(31.89%) ,β折叠78个(21.08%)、β转角46个(12. 43 % )、无规则卷曲128个(34. 60% )。 α毒素及α毒素D56 G突变体蛋白分子3D结构预测 结构预测α毒素和α毒素D56 G突变体蛋白分子3D结构的预测结果显示，α毒素一共有10段α螺旋，8段β折叠，而α毒素D56G突变体蛋白的3D结构与α毒素的3D结构相似 α毒素及α毒素D56 G突变体蛋白分子的圆二色光谱分析 圆二色(CD)光谱仪测定了α毒素及α毒素D56G突变体蛋白分子的CD光谱，结果显示，α毒素分别在207 nm和209 nm处有一个凹峰，而α毒素D56 G突变体蛋白则没有 重组菌株BL21 (DE3) (pM-D56 G)生物学活性的测定 免疫攻毒试验结果表明，重组菌株BL21 ( DE3 ) ( pM-D56G)包涵体抗原免疫组保护率为92.5% (74/80) A型魏氏梭菌标准株C57一1类毒素抗原免疫组保护率为95% (76/80)，而生理盐水对照组20只小鼠全部死亡，这说明构建的α毒素D56G突变体蛋白具有较好的免疫保护效果。 免疫攻毒试验 谢谢观赏 WPS Office Make Presentation much more fun @WPS官方微博 @kingsoftwps 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 底物除4种正常的dNTP外，还包括一种特殊结构的脱氧核糖核芳酸类似物在缺口填补过程中，该类似物掺人到DNA链的一处或多处。 首先将待突变的目的基因克隆在M13—RFDNA裁体上，转化大肠杆菌，拂挑选选重组噬菌斑，从中分离出DNA重组正链；人工合成与待突变区域互补的寡聚核苷酸引物，并在此过程中设计引入突变碱基,然后在较温和条件下与DNA重组正链退火，经DNA体外复制和连接后，双链分子重新转化大肠杆菌；以上述合成的寡聚核昔酸片段为探针，在严格条件下(如将杂交温度提高5一10℃）杂交筛选合有突变碱基的噬茵斑，从