第六章酶的分离与纯化资料.ppt

酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用. 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。 亲和层析的四个要素 三、酶的纯度及活性检验 （一）酶纯度的检验 一些常用的检验酶纯度的方法 方 法 备 注 超速离心 对检测少量杂质（＜5％）时不太满意，当存在络合一解离体系时也会出现问题 电 泳 必须在多种pH值下进行，在单一pH值下，两种酶可能一起移动 SDS电泳 检测与亚基分子量不同的杂质的一个主要方法，对检测制备物中蛋白水解酶的水解作用非常有用，酶由不同亚基组成时，会出现多条区带 等电聚焦 检测杂质的极灵敏方法，有时当存在表观异质时，会出现假象 N-末端分析 应该指明只存在单一多肽链，有些酶具有封闭和N-末端，另一些酶则由二硫键连接的几条肽链组成 免疫技术 高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦 第二节 酶活力测定 酶活力（enzyme activity）的概念 酶活力也称为酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。 注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。 酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。 一、酶活力单位 定义：在规定条件下，酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。 惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 ALT的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法 金氏法： 1μmol丙酮酸/每100ml血清(37℃,60min) 穆氏法： 5μg丙酮酸/ 1ml血清(37℃,60min) 赖氏法：在规定条件下（血清1ml，反应液总量3ml，25℃，作用1min，内径1cm比色杯）测定340nm波长处，吸光度减少值，每减少0.001为一个酶活性单位。 国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1?mol底物所需的酶量,或是转化底物中1μmol的有关基团所需的酶量,单位为1?mol /min,或1?mol.min-1 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物所需的酶量，单位为1mol/s或 1mol.s-1 Katal与IU的换算关系 ： 1Katal=60×106IU=6×107IU 1IU = 16.67nkatal 比活力 （specific activity） 在特定的条件下，单位质量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数 酶比活力=酶活力（单位）/mg（蛋白质或RNA）。 比活力作为酶制剂纯度的常用指标 二、酶活力测定方法 （一）按照酶促反应时间分类 连续监测法 固定时间法 以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性 在多个时间点连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度 特点： 优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。 注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分钟为宜。 1.固定时间法 定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。（两点法） 2.连续监测法 原理： 定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。 该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。 特点： 在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法 缺点： 要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。 优点: 能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。 （二）按监测方法分类法 1．分光光度法及比色法 2．酶偶联测定法 3．荧光法和同位素法 4．量气法 5．电化学测定法 几种常用酶活的测定方法优缺点及应用范围 方法 方法介绍/原理 检测特点/优缺点 应用/举例 酶偶联测定法 将该酶作为试剂加入到待测的酶促反应体系中，使本来不易直接测定的反应转化为可以直接监测的系列反应。 加入的偶联工具酶应该高度纯净、专一而且过量，使测得的反应速度和酶浓度间有线性关系。偶联指示酶的用量一般应为被测酶的