第5讲目的基因向植物细胞转化与转基因植株的筛选鉴定解读.ppt

* 添加了抑制农杆菌生长的抗生素，如卡那霉素、羧卞青霉素或潮霉素等 * (2)转化方法待玉米植株生长至开花期,按常规方法进行雌!雄花套袋隔离,雄花套袋隔离24h后对雌花进行授粉,授粉后在所设时间段内,与穗轴顶部相齐切掉花柱和苞叶,但不要伤到雌穗,然后用移液器吸取转化元件溶液150川(浓度为100ng小l左右,溶解于0.1!ssc溶液中)均匀滴在切割后的花柱上(图2.2),对照植株只转化0.1xSSC溶液然后在整个雌穗外面套袋,待果穗成熟收获 * 氨基环醇类抗生素如卡纳霉素、新霉素、庆大霉素等 * * 点渍法与纸层析法特点是简单、快速。 * DTNB：5,5-二巯基-2,2-二硝基苯甲酸 GS--谷氨酰胺合成酶 Bar基因编码的产物：乙酰辅酶A转移酶 * * 利用两条单链DNA的碱基互补性，来检测外源DNA的转化结果， * 32P标记的核苷酸放射性高，因而放射性自显影灵敏度高，压片时间短，应用比较广泛，但分辨率低，在细胞原位杂交中使用受限制。 35S的射线较弱，其标记的探针检测灵敏度低，但分辨率高，本底低，适用与原位杂交。 * 生物素是连接在核苷酸的碱基上的， * * * 生物素是通过烷烃链接臂与核苷酸中的嘧啶碱基的第5位的C原子通过共价键结合的 * 放射性自显影法与普通照相的曝光、显影、定影原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射线使照相乳胶“感光”，再经显影和定影处理，将乳胶中因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金属银，洗去未“感光”的卤化银后则图像自然显示出来。图像中任何区域的黑度取决于留存的金属银的量，它反映了射线在这个区域所沉积的能量。 * * * 要用非转化植株做对照，即阴性对照。膜可用硝酸纤维素膜或尼龙膜。尼龙膜比较好，但缺点是在杂交信号本底高，克服办法是加大预杂交液中封闭剂的用量，以覆盖膜上非特异性位点。硝酸纤维素膜对探针与蛋白质的吸附作用较弱，因而本底低，但缺点是对小于200bp的DNA结合较差、质地较脆，烘烤后易破碎。 * 一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。 Southern印迹 毛细管吸附法原位转移DNA 3、Southern杂交步骤 提取转基因植物的DNA 限制性内切酶消化 琼脂糖凝胶电泳 碱性溶液中使DNA解离成单链 转膜：凝胶上的DNA区带按原位转至膜上， 即印迹 与探针杂交 洗膜 显影 试剂： 变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。 中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)， 1.5mol/L NaCl。 20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。 以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。 2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL， 加无菌水45mL。 6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。 操作方法： 1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。 2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。 3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。 4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。 5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。 6. 裁剪一张硝酸纤维膜或尼龙膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。先把它放在去离子水中润湿后，再放在20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，两层之间不可有气泡。 7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜上，同样要把气泡赶走。 8. 把一叠吸水纸（或卫生纸，约有5—8cm高，略小于滤纸），放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。 9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。 11. 把已转移了DNA的硝酸纤维膜放在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液。再把它夹在两层滤纸之间，80℃真空干燥2小时或用紫外线交联将DNA固定在膜上。 注意：