本科生《P》-第四章PCR-资料.pptVIP

免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素(ProteinA-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA)(Biotin-pUC19)中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。 第四节 Real-time PCR 一、实时定量PCR定义 实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量 PCR是目前确定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝数最敏感、最准确的方法。 二、荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR检测时,在普通PCR的基础上加入的荧光化合物，扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。 Extension 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Extension Continued Apply Excitation Wavelength 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ Taq Taq 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ Repeat DNA binding dyes BD BD BD BD BD BD BD BD BD BD l l l l l Ct值（Ct value） and Real-Time Quantitative PCR Theory（Threshold Cycle） 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。 在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 Ct值（Ct value） and Real-Time Quantitative PCR Theory（Threshold Cycle） 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号标准偏差的 10 倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值。 三、Ct值与模板起始浓度的关系 模板起始浓度越高，Ct值越小。 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系。 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达； 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达； 绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度； 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 四、荧光定量PCR和常规PCR技术的区别 常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）； 荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法（准确定量） 。 五、实时荧光定量 PCR技术的应用 1 DNA或RNA的定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。 2 基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证 3 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。 第五节 RAPD and sev