PCR技术及其应用(周俊宜)资料.pptVIP

探针杂交 NC膜 探针 正常人 突变纯合子 突变杂合子 PCR-RFLP法： 限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） Ras基因 突变 限制性内切酶 正常 突变 电泳 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法 PCR-SSO法 PCR-SSCP PCR-SSP 3)基因配型 PCR-SSP 1 2 3 4 5 6 7 8 PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 引物特异性 4）基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序 PCR-VNTR多态性检测 PCR；电泳检测 父’ 父 子 母 现 嫌1 嫌2 嫌3 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 PCR的类型和应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物 低浓度引物 2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 3）多重PCR 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记，用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 5）锚式PCR 已知靶基因片段两测的序列 VH CH1 CH1 CH2 CH2 CH3 CH3 VH VL VL CL CL cDNA 末端核酸