选3.1.2 基因工程的基本操作程序解读.ppt

复习:基因工程的基本操作步骤 提取目的基因 目的基因与运载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基因的表达和检测 提取目的基因 目的基因与运载体 结合 将目的基因导入 受体细胞 目的基因的表达 和检测 一、目的基因的获取 1、目的基因： 主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子 2、获取方法： （1）可以从自然界中已有的物种中分离出来 （2）也可以用人工的方法合成 (1)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 基因文库的构建模式图 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 总结：表达载体需由哪几部分组成？ 目的基因 标记基因 启动子 终止子 复制原点 PCR技术原理 及反应过程 原理： DNA双链复制 反应过程： 1.加热至90～95 ℃ 目的基因DNA解链 2.冷却至55～60 ℃， 引物结合到互补DNA链 3.加热至70～75 ℃， 热稳定DNA聚合酶从 从引物起始互补链的 合成 ⑥过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 ①反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 ②根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 1．提取目的基因方法的比较 方 法 基因文库的构建 PCR技术 扩增 人工合成 基因组文库 部分基因文库(如cDNA文库) 过 程 供体细胞中的DNA ↓限制酶 许多DNA片段 ↓连接 表达载体 ↓导入 受体细胞 ↓ 外源DNA 扩增，产生 特定性状 ↓分离 目的基因 目的基因的 mRNA　 ↓反转录 单链DNA ↓合成 双链DNA ↓插入 载体 ↓导入 受体菌群 (cDNA文库) ↓分离 目的基因 目的基因 DNA　 高温 解链 单链DNA 与引 物结合 、DNA 聚合 酶 大量目 的基因 蛋白质的氨 基酸序列　 ↓推测 mRNA的核 苷酸序列　 ↓推测 基因的核 苷酸序列 化学 合成 目的基因 方 法 基因文库的构建 PCR技术 扩增 人工合成 基因组文库 部分基因文 库(如cDNA 文库) 优 点 操作简单 专一性强 可在短时间内大量扩增目的基因 专一性强，可产生自然界中不存在的新基因 缺 点 工作量大、盲目性大、专一性差 操作过程较麻烦，技术要求过高 需要严格控制温度，技术要求高 适用范围小 2．PCR技术与生物体内DNA复制的比较 DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋 场所 细胞内(主要在细胞核内) 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等 耐热的DNA聚合酶(Taq聚合酶) 温度条件 细胞内温和条件 需控制温度，在较高温度下进行 合成的对象 形成整个DNA分子 短时间内形成大量DNA片段或基因 联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成 ②原料：均为四种脱氧核苷酸 ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化 ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 [特别提醒] (1)基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达。 (2)通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。 (3)热稳定DNA聚合酶(Taq聚合酶)能在高温下保持其活性，是PCR技术关键的工具之一。 1.用一定的__