荧光显微镜技术-抗核抗体检测2解读.ppt

荧光免疫显微技术－抗核抗体检测 邓念华 检验医学院临床免疫学教研室 一、原　理 即采用间接法对自身抗体－抗核抗体（ANA）的检测。 以小鼠肝细胞或HEP-2细胞作为抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。 再加入荧光素标记的抗人IgG抗体再与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。不同荧光核型对自身免疫性疾病有诊断意义。 二、主要试剂及器材 试剂： 　FITC标记的抗人IgG抗体、缓冲甘油、0.01mol/L pH7.2 PBS 器材： 　荧光显微镜 固定 染色★ 37 ℃30min ★ 3.荧光显微镜检查 1.抗原片制作 2. 荧光抗体染色－间接 法 三、操作方法 1．抗原片制作 肝印片制备： 固定：　丙酮　室温10min 　　固定的目的是什么？ 抗原片可冰箱保存一周。 固定： 作用 ： ①防止标本从玻片上脱落； ②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果； ③固定的标本易于保存。 原则： ①不能损伤细胞内的抗原； ②不能凝集蛋白质； ③不能损伤细胞形态； ④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。 2.荧光抗体染色－间接法 间接法原理示意图 1）处死小鼠取肝制作肝印片，用丙酮固定10min。 2）待测血清作用PBS作1:10稀释，加50ul于抗原片上，37度温育30min。 3) 取出抗原片，用PBS冲洗，3次×3min/次。再用双蒸水冲洗，冷风吹干。 4）滴加1:20的稀释FITC－抗人IgG抗体，37度温育30min。 5）取出抗原片，用PBS冲洗，3次×3min/次。再用双蒸水冲洗，冷风吹干。 6）滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。 对照设置： 1）标本自发荧光对照： 　　抗原片只中加缓冲液后观察，结果阴性。 2）荧光抗体对照： 　　抗原片只加荧光抗体染色，结果阴性。 四、结果观察 首先观察对照，再观察待测样本。 细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。阳性血清可进一步稀释后测定效价。 荧光核型观察。 均质型 主要见于SLE 结果观察： 核膜型 主要见于SLE，且提示病情活动。 结果观察： 斑点型 高滴度见于结缔组织病 结果观察： 抗核仁型 对硬皮病诊断有一定特异性，但也见于雷诺病。 结果观察： 五、分析及讨论