基础知识课时36基因工程技术报告.docVIP

课时36 基因工程 一．基因工程的诞生和发展 艾弗里证明DNA是遗传物质 理论基础 DNA双螺旋结构和中心法则的确立 尼伦贝格破译了遗传密码 1973--1976开始期：1973年，美国的科恩创立了基因工程 发展 1977--1981发展期：在大肠杆菌中成功表达了生长激素抑素基因、人胰 岛素基因、人生长激素基因、人干扰素基因 1982年以后为迅猛发展和实际应用期： 1982年，美国的帕米特采用显微注射法培育出巨型小鼠 二.基因工程的概念（别名：重组DNA技术） 基因工程是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。 基因工程特点：1.它是一种按照人们的意愿，定向地改造生物遗传特性的技术； 2. 在DNA分子水平进行操作； 3. 原理：基因重组；（是在生物体外进行的人为的基因重组） 4.基本过程：剪切→拼接→导入→表达 三.基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：切割外源DNA,对自身的DNA不起作用,达到保护自身的目的. (3 )特点: 专一性:只能够识别DNA分子中特定的核苷酸序列(这种能被特异性识别的部位都具有回文序列)，且只能在每一条链的特定部位进行切割. (4)作用实质:使特定部位的两核苷酸之间的磷酸二酯键断开 （5）结果：经限制酶切割产生DNA片段末端. 通常有两种形式：错位切-----黏性末端 平切------平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)作用:催化两种DNA片段之间形成磷酸二酯键 E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶的区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体的作用：①作为运载工具，将目的基因送到受体细胞中去； ②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 （2）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 ③具有标记基因，以便对受体细胞进行筛选。 载体必须包括三部分：复制区、标记基因、限制酶的切割位点。 （3）载体的种类：质粒、噬菌体、动植物病毒 最常用的载体是质粒,它主要存在于细菌细胞中，是具有自我复制能力的小型环状DNA分子。 四．基因工程的基本操作程序 第一步：获取目的基因 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因 2.目的基因的获取方法： 从供体细胞直接提取——主要是原核生生物基因 从基因文库中获取 利用mRNA反转录形成 利用PCR扩增技术 人工化学法合成 ①基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库。 ②目的基因的获取依据：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等。 ③原核基因采取直接分离获得，真核基因人工合成：常用方法有反转录法_和化学合成法 人工合成目的基因的不含非编码区和内含子。 3. PCR技术扩增目的基因 （1）PCR的含义：是一项在生物体外大量扩增特定DNA片段的技术。场所：PCR扩增仪 （2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA复制 （4）过程： 第一步：加热至90～95℃目的基因DNA受热变性解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA互补序列结合； 第三步：加热至70～75℃，TaqDNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数(2n)形式扩增 第二步：制备重组DNA分子(基因表达载体的构建) 1.目的：①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代; ②使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是位于目的基因上游的一段核苷酸序列，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：是载体中终止转录的核苷酸序列，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基