基因工程知识要点讲解.docVIP

第一章 1.基因工程:是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。 2.基因工程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检 ① 获得目的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，用内切酶将外源DNA切开。——切（同时选择运载目的基因的载体）② 目的基因与载体DNA拼接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子。 ——接 ③ 重组体分子导入受体细胞：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。——转 ④ 短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。 ——增⑤ 筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。 ——检 3.哪些基因是真核生物特有的？ ① 假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。 ② 基因家族：由功能相关的基因成套组合形成 ③重复序列 哪些是原核生物特有的：插入序列。哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因 第二章 1. 寄主细胞控制的限制与修饰 宿主控制限制——核酸限制性内切酶 宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶 以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。 （简述寄主控制的限制与修饰现象。 大多数细菌的噬菌体侵染都存在着一些功能性障碍。所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的 R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解； 2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。 （1）Ⅰ型酶基本特性 ① 有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥② 需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因子；③ EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。γ多肽链：特异性亚基，识别DNA序列的活性。β多肽链：修饰亚基，具有甲基化酶活性。α多肽链：限制亚基：具有核酸内切酶活性④ 有特定的识别位点⑤ 切割方式：结合在识别位点，以滚环形式沿着DNA分子转位，从距识别位点5 ’一侧几千bp处随机切割分子，无特异性。 Ⅱ型酶：①有内切酶活性和甲基化酶活性——分开反应②能识别专一的核苷酸序列，并在固定位置上切割③识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构（那项具有回文结构：识别位点的DNA序列呈双重旋转对称 ）④切割可形成两种核苷酸切割末端————粘性末端和平末端。粘性末端定义 ：指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，能通过互补碱基间配对而重新环化起来。 （3）Ⅲ型酶：① 由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有内切酶活性和甲基化酶活性 ② 需Mg 2+、ATP、SAM辅助因子③可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24 ～ 26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的 4. 同尾酶：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 同裂酶：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 星号活性：同一限制酶当某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，即酶切位点专一性改变的活性。包装上标“＊”注明。 5.DNA缺口平移、取代反应的概念 DNA缺口平移：在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ⅰ的5’ → 3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。 （概念：当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但PolⅠ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去， 3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。） ② 用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。 取代反应：如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的3’→5’ 的外切酶活性将从ds DNA的3’端降解，直到互补于该dNTP的碱基出现为止，然后在该位置发生合成和取代反应。 6.各DNA聚合酶的基本特性及其区别； （1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）的酶活性 ① 5’ → 3’的聚合酶活性：需Mg2+ ② 5’ → 3’的外切酶活性：可以从游离的5’-OH末端水解DNA分子(修复作用) ③ 3’ → 5’的外切酶活性（较低）：从DNA链的3’-OH末端向5’水解DNA(校对