冷冻保存对绵羊精子谷胱甘肽还原酶活性的影响要点讲解.docVIP

学校编码：15014 分类号 密级 学号： 10171340101 UDC 本科毕业论文(设计) 冷冻保存对绵羊的影响 5 月 30 日  赤峰学院本科毕业论文(设计)原创性声明 兹呈交的毕业论文(设计)，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文(设计)写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文(设计)而产生的权利和责任。 声明人（签名）： 指导教师（签名）： 年 月 日  冷冻保存对绵羊精子谷胱甘肽还原酶活性的影响 段超凡 赤峰学院生命科学学院，赤峰 024000DTNB比色法对冷冻保存前后精液，精子和精清中谷胱甘肽还原酶活性进行了研究。结果冷冻保存后精液[（15.10±0.959）UL]、精子[（7.06±0.635）U/L]和精清[（6.76±0.777）UL]谷胱甘肽还原酶活性与冷冻前相比[（8.16±0.915）U/L）] 、[（3.98±0.789）U/L）]和[（3.10±0.524）UL]均极显著升高（P﹤0.01）。表明超低温冷冻过程对绵羊精子中的谷胱甘肽还原酶活性影响严重。 关键词：绵羊 ； 精子 ； 冷冻 ； 谷胱甘肽还原酶 精液冷冻保存是人工授精技术的关键环节。它解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，极大限度的发挥和提高优良种公羊的利用率，加速品种的育成和改良步伐，在进行血统更新、引种、减低生产成本等方面具有重要意义[1]。但是冷冻保存是会对精子结构与功能造成损伤，导致精液质量下降。有研究表明“前顶体酶和顶体酶抑制剂可以明显抑制精子穿透卵细胞的透明带，降低受孕率，而精子的活动力和前进速度并没有明显改变” [2]。所以根据精子的活动力与前进速度不能准确判断精子受精能力，精液中与精子关联密切的酶及其活性对精子的受精能力也有一定的影响。 精子中存在一个由酶组成的保护系统，谷胱甘肽还原酶( Glutathione reductase，GR)是这个保护系统中的关键酶，可催化氧化性谷胱甘肽（oxidized Glutathione，GSSG）还原成还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)， GSH在细胞内能消除有害活性氧( reactine oxygen species， ROS)，阻断脂质过氧化链锁反应， 从而起保护细胞膜结构和功能完整的作用[3]。研究表明低温冷冻过程中会大量产生活性氧[4]，因而GR在缓解冷胁迫产生的活性氧危害具有重要的功能 。 目前，有关GR活性的研究主要集中在人类血液、小鼠组织、鱼类精子[5-8]，对家畜尤其是绵羊精子GR活性的研究还鲜有报道。本实验对冷冻保存前后小尾寒羊精液、精子及精清中GR活性变化规律进行了研究，以期为优化绵羊精液冷冻保存技术，提高冷冻精液品质和体外受精过程中选种、配种提供理论参考。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 甘油，D-（+）-葡萄糖，蔗糖，青霉素，链霉素（sigma）；5 5’- ( 2-硝基苯甲酸 ) ( DTNB ) （美国 Alfa Aesar）；柠檬酸钠，氯化钠，纯乙酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠 ( GSSG ) ，谷胱甘肽 ( GSH )，原型辅酶II（NADH）–100，三氯醋酸(TCA)溶液（天津科密欧化学试剂开发中心）；ＭilliQ超纯水纯化系统获得） 1.2 主要仪器 ZONKIA HC-2518）、紫外可见分光光度计（TU-1810 北京普析通用）、显微镜 (OLYMPUS) 1.3 稀释液的配制 。取NaH2PO4 0.0623 g、Na2HPO4 0.414 g 用少量的超纯水溶解后定容至20 ml 酸度计测量，配置成PH 约为7.，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液。 取g还原型辅酶II（NADH），加入ml超纯水，配制成mmol/L 还原型辅酶II（NADH）溶液。取g GSSG，加入ml超纯水，配制成mmol/L GSSG溶液。3. 07 mgGSH， 用磷酸盐缓冲液溶解并定容于10 ml量瓶中，配制成1. 0 mm ol/ L GSH ( 临用前配制) 。 以上配液除需临用前配制，配置后在均置于4冰箱保存1.4精液的采集和要求 选取体况良好，性欲旺盛的同一只小尾寒羊种公羊，按常规方法采集精液。采精频度，一般采用连续采精2 d，休息1 d。在采精当日可连续采2次（间隔10-15 min）。精液采出后，立即于37 ℃ 下进行常规品质检查，要求原精液无异味，色泽为乳白色，精子形态正常，原精液的活力要求不低