分子生物学常用技术WXK-凝胶电泳技术杂交技术-资料.pptVIP

复性 RNA DNA 杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是基因组DNA,细胞总RNA或克隆的基因片段等。将标记的已知核酸片段作为探针(probe)，与待测样本核酸进行杂交反应，即可观察到样本核酸中相应的序列。 二、探针的种类与标记 探针 (probe)：一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC（硝酸纤维素滤膜）膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。探针的选择与标记是杂交技术成功与否的关键。 (一)探针的种类 基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。 1.基因组DNA探针： DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。 这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 这些DNA片段须是特异的，以细菌为例，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。 DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点： ①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。 ②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。 2.cDNA探针： cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经逆转录酶催化产生的。利用mRNA反转录合cDNA，经PCR扩增可制备大量cDNA探针。比较理想的核酸探针，但不易获得。 3.RNA探针： 是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，很少含有重复序列，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。来自从细胞中直接提取mRNA或利用DNA合成仪上合成小片段的RNA。 RNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。 4.寡核苷酸探针: (人工设计，合成) 寡核苷酸探针具有一些独特的优点： ①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。 ②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，这是因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。 ③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这种探针价格低廉。 （二）探针的标记方法 核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有32P和35S。前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制（32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I的半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β放射线能量太低（0.018Mev），只能用于组织原位杂交。 ??1.? 放射性核素的标记 （1）切口平移法：该技术由Kelly等于1970年创立。是目前最常用的一种脱氧核糖核酸的探针标记法。是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，从而合成高比活的均匀标记的DNA探针。线状、超螺旋及带缺口的双链DNA匀可作为模板。首先，极微量的DNaseⅠ在Mg2+的存在下，在DNA链上随机形成单链切口。利用大肠杆菌DNA聚合酶的5`→3′核酸外切酶活性在切口处将从旧链5`—末端逐步切除。同时，在DNA聚合酶Ⅰ的5`→3′聚合酶活性的催化下， 顺序将dNTP连接到切口的3`末端—OH上，以互补的DNA单链的模板合成新的DNA单链。如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸（如32P—dCTP），则这些标记的核苷酸将替代原来的核苷酸残基，从而形成高放射性活性的DNA探针。 （2）随机引物法(random priming) 　所谓随机引物法是含有各种 可能排列顺序的寡聚核苷酸片段的混合物，因此它可以与任意核酸 序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用。将待标记的DNA探针片段 变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，在 Klenow片段的