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动物细胞培养技术 基因工程与动物细胞培养 药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构，要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。 细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。 原核细胞表达的红细胞生成素(EPO)无糖基化，在体内表现无活性。原核表达的粒细胞-巨噬细胞刺激因子 (GM－CSF)虽有活性，但在体内产生抗体。 几个概念 传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 有限细胞系，无限细胞系 细胞系 (cell line)：原代培养物经首次传代成功即称为细胞系 细胞株 (cell strain)：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株 培养细胞的特性 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 兼性贴壁培养 原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例） 取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清 消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养 原代细胞培养结果 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层 传代细胞培养 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭。 从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞倍增3～6次。 传代细胞培养操作 将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟； 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液； 将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。 传代细胞培养结果 一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代 实验用品 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管 超净台 滤 器 CO2培养箱 合成培养基: 目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定、成本低。 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 还需补充一定量的天然培养基（5~10%血清）。 血清质量好坏是实验成败的关键 常用血清：胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。 血清的灭活：56 ℃ ，30 分钟（消除补体活性）。 血清的消毒：过滤除菌。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 抗菌素的使用： 青霉素和链霉素联合使用；培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定 培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％） 消化液： 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的