proteomics-2012()摘要.ppt

蛋白质组学这部分，大家掌握下面三个问题就可以了 ： 简述蛋白质组学研究中常用的四类研究技术，并举例说明具体包括哪些方法。 简述生物质谱的基本工作原理。质谱仪的主要组成部分及功能？ 如果你现在研究的材料（例如某种细菌、真菌、藻类、植物、动物或某类培养细胞）需要用到双向电泳技术来分离，该样品的前处理步骤有哪些（即样品制备的步骤）？ 常用的串联质谱数据检索工具 1. 不同的蛋白质样品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8,首先分别进行蛋白酶水解（通常为胰蛋白酶Trypsin）. 2. 采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合。 3. 使用液体色谱和质谱的联用进行一级质谱。 4. 8个不同来源的，同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个峰。 5. 对加入标记的肽段进行二级质谱，这时，平衡基团从报告基团上脱落。 6. 二级质谱后，报告基团在二级质谱低质量区域产生8个报告离子信号：113、114、115、116、117、118、119和121，其强度分别代表8个标记的样品的同一个肽段。 7. 报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值. （1）所得到的一级质谱图（MS）：下图 （2）对一级质谱图的每个峰进行二级质谱图（MS/MS）左上图： （黄色部分为报告基团的峰，因为横坐标比例大，没显示出多条峰）（3）下图为上图的黄色部分报告基团的峰的放大图（横坐标的数量级小，所以显示出多个单峰） 8、对质谱仪所得的数据进行生物信息分析，定性和定量研究。 所使用的部分搜索软件与网址： SEQUEST MASCOT pFind / iTRAQ技术优势 灵敏度高：可检测出低丰度蛋白； 分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等； 适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。 高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析； 结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息； 自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。 可同时定性和定量 iTRAQ实验结果示例 1: 提取各组蛋白质、定量并用胰酶酶切； 2. 各组肽段分别用4种iTRAQ试剂标记 (例如对照组用iTRAQ 117标记，其他3个实验组分别用iTRAQ 114, 115, 116标记)； 3. 标记好的各组样本等量混合，液相分离和质谱分析. 4: 不同样本中蛋白质的差异表达可通过二级质谱中iTRAQ试剂的峰面积确定，如图所示：与对照组相比，该蛋白在3个处理组(114-116)中的相对表达量较高。 5. 根据该肽段的二级质谱峰图，结合数据库检索，得到蛋白的定性信息。 第三节 蛋白质组功能模式的研究方法 揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。 （一）蛋白质翻译后修饰的研究 翻译后修饰 糖基化 乙酰化 甲基化 羧基化 二硫键 磷酸化 磷酸化研究的方法 液相色谱－电喷雾质谱 磷酸肽选择性母离子扫描 MALDI反射式分析 荧光标记（32P） 抗体检测（商品化的磷酸化抗体） （二）蛋白质相互作用研究技术 生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。 以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。 1．酵母双杂交系统 （Yeast Two-hybrid System） 转录激活因子GAL4的特点 N端含与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UASG)结合的结构域（BD） C端含GAL1转录激活结构域(AD) 功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性 主要特点和优势 最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 真实反应体内蛋白质间相互作用情况 可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 敏感性高 缺 点 1.假阳性结果 某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定 的复合体