动物细胞培养要点详解.pptVIP

动物细胞体外培养Animal cells?cultured in vitro 一、基本概念 动物体内取出组织，分离出单细胞，在体外模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术，称动物细胞体外培养。 是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、动物细胞产品的大规模制备技术等都离不开～。 （1）原代培养 ( Primary Culture ) ： 亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进 行培养的过程。 （2）继代培养（ Secondary Culture ）： 亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称 继代培养. （3）细胞系（cell line）： 由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞 为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，能保 持一致的二倍体核型。 （4）细胞株 ( cell strain ) ： 细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞 群体。 二、动物细胞体外培养特性 组成人及哺乳类动物体的细胞具有极其复杂的结构和功能，细胞在机体内生长时相互依赖、相互制约，在神经体液的调解下形成了一种天然的内环境，体外生长时脱离了这些内平衡系统，与体内细胞相比是完全不相同的。体外生长时，细胞形态上也发生了变化。 1.与体内主要不同相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 ； 2.主要表现：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，细胞趋向单一化； 3.提示：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。 三、体外培养细胞的生长与增殖过程 培养的细胞持续生长的时间有限，最终自行停止 生长。细胞的种类、性状、原供体的年龄决定其生存 时间长短。 如：人胚成纤维细胞存活一年、传30-50代相当 于150-300个细胞周期；供体是成体或衰老个体时 则存活更短；肝、肾细胞仅能传几代或十几代。 获永生性或恶性转化（遗传性改变）生存期则发 生变化。 （一）细胞系的生长过程 1、原代培养期（primary culture phage) 为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段,一般持续1~4周。细胞的代数=转接的次数。每一代中细胞分裂3-6次。 2、传代期 （passage phase）： 当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。 3、衰退期（senescence phase）：此期细胞虽仍存活，但不增殖或增殖很慢，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。 ?? 细胞通过所谓“危机期”(crisis)，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。 每代细胞（群体）要经过四个生长阶段： 1、潜伏期（latent phase）： 接种——悬浮——贴附——不马上分裂（潜伏）。 潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用培养基性质有关。 2、对数生长期（logarthmic growth phase）： 分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛 程度）。 细胞分裂指数（mitotic index, MI）: MI=(分裂相个数∕1000个细胞) ×100% 。 3、稳定期（stationary phase）：因培养空间和营 养物质有限，特别是代谢废物的累积，细胞进入： 新分裂的细胞数与死亡的细胞数相等的动态平衡时 期。细胞数不增加，但代谢还是活跃的。 4、衰亡期（senescence）：营养物的耗尽和有害 物质的作用，细胞死亡数大于细胞分裂数。 超净工作台 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料培 养皿和培养板等表面消毒 滤 器 培养瓶 CO2培养箱 （二）动物细胞的体外培养一般条件 1、恒定的温度: 37 ℃ 2、pH：最适为7.2～7.4 3、气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子等。 （1）血清： 主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、人血清，各有特点。含各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生长因子及无机物等。在生理平衡下促进或抑制细胞生长。成分复杂，不同种类、不同厂家、不同批号作用均有差异。 血清提供细胞生存、生长和增殖必需的激