基因工程及其在食品中的应用解读.pptVIP

Fall, 2001 Biotech 黃金米 转基因植物与农作物的抗性 耐储转基因农作物 转基因植物 基因工程疫苗 DNA体外重组方式： 通过DNA连接酶实现 DNA体外重组方式： 主要为粘性末端连接法（或称粘接法），也可以用平头连接法。 粘性末端连接法又可分为两种：直接粘接和加尾粘接。 直接粘接 加尾粘接法 重组DNA分子在体外构建完成后，必须导入到受体细胞中，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状。 导入受体细胞的方法：包括转化、转导、杂交等，这些导入方法在DNA重组技术中统称为转化操作。 第五节???转化、增殖和表达 1、受体细胞 基因工程中的受体细胞是指能接受外源DNA并使其稳定维持的细胞。 常用的受体细胞微生物中以细菌为主，此外还有放线菌、酵母菌，另外有哺乳动物细胞和植物细胞。 一、转化（transformation） 重组DNA分子导入原核生物细胞常常采用的三种方法：转化、转导和杂交 转化：携带基因的外源DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程称为转化（transformation）。 2、转化、转导和杂交 能进行转化的受体细胞必须处于感受态。 感受态：也就是受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。 感受态出现的时期：一般在对数期的后期。 细胞感受态的出现与以下因素有关：微生物本身遗传特性、菌龄、生理状态、培养条件等都影响感受态的形成。 感受态细胞的制备方法是将细胞培养到对数期，然后采用Cacl2溶液处理可以使感受态细胞在1—2天内能有效地吸收外界的DNA分子。 将制备好的感受态细胞和外源DNA在一定条件下混合并进行适当的处理，就可以得到一定量的转化子。 转化子：受体细胞接受了外源基因，从而得到了新的基因型、新的性状，就叫转化子（重组子）。 影响转化效率高低的因素: 受体细胞的感受态； 重组DNA分子的构型和分子的大小，环状DNA分子和相对分子质量大的重组DNA分子，其转化效率越低； 加入CaCI2和MgCl2处理以及加人六胺氯化钴等都可提高转化率。 转导（transduction）： 通过噬菌体（病毒）感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。 含有目的基因的DNA与噬菌体载体的重组DNA分子导入受体细胞，一般先需要进行体外包装。 二、DNA连接酶 DNA连接酶（DNA ligase）： 能催化两个DNA片段末端之间的3′-OH和5′-P基团形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶称为~。 种类： ①大肠杆菌DNA连接酶（E.coli DNA连接酶） ? ② T4-DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶只能连接具有互补粘性末端的DNA片段，反应系统中必须含有NAD作为辅助因子。 T4-DNA连接酶即可以用于双链DNA片段互补粘性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。反应系统中必须加有ATP作为辅助因子。 三、DNA聚合酶 常使用的DNA聚合酶有： 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和T4 DNA聚合酶等。 DNA聚合酶的共同特点： 能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合。 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5′—3′的DNA聚合活性：催化单核苷酸结合到DNA模板的3 ′-OH末端，以单链DNA为模板，从引物的3 ′末端按模板顺序从5′ 3′延伸。 CCG E.coli DNA polⅠ CCG ATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+ 4dNTP GGCTATCGGA 目前采用的碱性磷酸酯酶有两种: 1、细菌碱性磷酸酯酶(BAP) 2、小牛肠碱性磷酸酯酶(CIP) 碱性磷酸酯酶能催化从单链或双链DNA或RNA分子中除去5′-磷酸残基，即脱磷酸作用，使DNA或RNA末端的5′-P成为5′-OH。 四、碱性磷酸酯酶 在基因工程中的应用： 1、在DNA重组技术中除去DNA片段的5′磷酸，防止自身环化。 2、在用32P标记DNA的5′磷酸末端之前，除去磷酸。 T4多聚核苷酸激酶：能催化ATP上的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5′-OH末端上，使其磷酸化。 主要作用是为DNA的5′末端标记，标记待测的DNA片段（ATP上的γ-磷酸是放射性的）。 五、T4多聚核苷酸激酶 S1核酸酶：其主要特征是降解单链DNA或RNA，包括不能形成双链的区域（如发夹结构中的环状部分），但降解DNA的速度大于