动物细胞培养与表达制备药用蛋白解读.ppt

倒置显微镜：组成和普通显微镜 一样，只不过物镜与照明系统颠 倒，前者在载物台之下，后者在 载物台之上，用于观察培养的活 细胞，具有相差物镜。 3、动物细胞传代培养 传代培养（Passage culture/Subculturing）是指 将原代培养的细胞继续转接培养的过程，一般可传代50代左右。传代培养期间的细胞称为细胞系。 注意：每进行一次分离再培养称为传一代，即从 细胞接种培养到分离再培养期间的一段时间。在 细胞的一代中，细胞约能倍增3～6次。 传代培养方法 悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接 吹打分散传代，或者采用自然沉降法加入新鲜培 养基后再吹打分散进行传代。 贴壁生长的动物细胞，原代培养细胞分裂增 殖扩展成片后需要进行细胞分离重新接种培养。 一般采用酶消化法进行传代培养。 视频：动物细胞培养技术: /v_show/id_co00XOTE5MDQzMg==.html 酶消化传代过程 1、吸出或者倒掉培养瓶内的 旧培养液。 2、加入胰蛋白酶和EDTA混合 液盖满瓶底，轻轻摇动培 养瓶。 3、2～5分钟后检查，有细胞 间隙变大、细胞质回缩现 象时添加培养液终止消化 。 4、吸出消化液，加入Hanks 液轻轻转动，洗去残留消 化液。 5、加入培养液，用吸管轻轻 吹打瓶壁，使细胞脱落制 成悬液。 6、计数，接种进行传代培养。 动物细胞的传代培养 11-5 细胞株与保存 1.细胞系(Cell line) 是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细 胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群 体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。 不能连续培养的为有限细胞系(Finite cell line)， 能连续培养下去的为连续细胞系(Infinite cell line)。 2.细胞株(Cell strain) 是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分 离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的 细胞群，称细胞株。 细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细 胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。 3 动物细胞株类型 包括： 原代细胞、传代细胞 有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理 想的药物生产细胞） 二倍体细胞、异倍体细胞 融合细胞、转化细胞、基因工程细胞 （1）原代细胞 常用有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、血液 淋巴细胞 1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞 生产脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进 行生物制药的先河。 缺点：具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等。 药物筛选、药理研究。 （2）二倍体传代细胞 二倍体细胞具有正常细胞的特点：二倍体染色体、 具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。 有限细胞 系（传代次数一般都不超过50代）。 WI-38： 1961年Wister 38研究所从女性高加索人 的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI- 38。培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用 于生产的二倍体细胞有对病毒敏感，第一个用于疫 苗（脊髓灰质灭活疫苗）生产。 MRC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。 （3）融合细胞 如杂交瘤细胞：脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合细 胞。用于抗体药物生产。 将药用蛋白基因转化入动物细胞培养，用于大量生产药物。 （4）基因工程细胞 （5）转化细胞 细胞转化是指细胞发生遗传改变而产生永生化， 即由限定性细胞系转化为连续性细胞系，可以在 体外进行无限传代和生长繁殖。 不同于癌细胞，没有致瘤性。 倍增时间短，对培养条件与生长因子要求低。 由于转化细胞常常由于染色体断裂而变成异倍体， 失去正常细胞的特点。转化细胞于20世纪80年代获得批准用于生产。 转化方法 1.细胞自转化 体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象 在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的 因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污 染等。 2.人工诱发转化 采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变 DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、 物理和病毒诱导剂。 CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)：从中国 仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株。 贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压 改变有较高的忍受能力。 CHO细胞能表达糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白 溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator， tPA)、促红细胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、 乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B virus surface antigen, HBsAg）、粒细胞集落刺激因 子（Granulocyte colony stimulating factor,G- CSF）、DNA酶I、凝