实时荧光定量PCR技术原理及其仪器分析要点.ppt

实时荧光定量PCR技术原理及其仪器分析 PCR 1983年 Cetus公司的Kary Mullis于12月16日第一次成功实验发明了PCR，并于1993年获得诺贝尔化学奖 1995年 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术 九十年代中期 PCR临床应用在国内全面展开 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 基线（Baseline） 荧光域值（threshold） 循环阈值(Ct) 荧光标记与探针类型 水解型探针：TaqMan探针 分子信标 SYBR Green I DNA结合染料 杂交探针 蝎子引物法 LUX引物 起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析 荧光PRC的系统结构 热模块系统 光学系统 荧光检测系统 分析系统 热模块系统 光学系统 荧光检测系统 CCD PMT，光电二极管，扫描机制 PMT，光电二极管，旋转机制 分析系统 SDS软件 使用方法 使用注意事项 1. 按照正确的开关机顺序操作 2. 应该定期备份的实验数据 3. 良好的实验室环境 常见问题 判断样本加热块是否被污染 不正常的高信号 → 污染 某个孔的信号明显高出其他孔 → 污染 清除样本加热块污染 乙醇→去离子水→蒸发 Q-PCR分析 荧光定量PCR的定量分析是根据标准曲线的每个标本的Ct值进行的。在获得各个标本的PCR扩增曲线后，计算机软件自动确定用于定量分析的Ct值。 标准曲线定量 采用已知物的标准曲线来定量未知目的物。 相对定量分析 用目的基因与对照基因进行样品间的比较。通过从目的基因的Ct减去对照基因Ct获得相对于对照基因的定量，循环数差别是基数2的指数，表示这两个基因的模板倍数差别。 标准曲线制作 荧光PCR的局限性 在标准曲线定量中，由于无一统一标准，各实验室所用的生成标准曲线的样品不相同，使实验结果缺乏可比性。 在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物是实验结果可靠与否的关键。 与传统PCR相比的不足之处 （1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此不能监测扩增产物的大小； （2）荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了荧光PCR的复合式（multiplex）检测的应用能力； （3）实验成本比较高限制了其广泛的应用。 荧光PCR应用实例 食品检测： 转基因食品 掺假食品 致病性检测 PCR效率（E）= 10 -1 (-1/S) 已知基因DNA 质粒载体 RNA样品 PCR RNA样品浓度 克隆 DNAase 光密度仪 纵坐标：Ct 横坐标：lgRNA模板数 RNA拷贝数 * PCR之父Mullis 循环次数 DNA的链数 1 　 21 2 2 　22 4 3 　 23 8 10 　 210 1024 20 　220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿 PCR循环次数与DNA产量关系 PCR特点：高效扩增、忠实复制 实时荧光定量PCR 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon SYBR Green SYBR Green 法工作机理 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才