DNA重组技术解读.ppt

重组DNA技术 Recombinant DNA Technology 第 一 节重组DNA技术概述  Overview of Recombinant DNA Technology  二、重组DNA技术是在体外利用酶对DNA进行重组的操作 重组DNA技术(recombinant DNA technology), 即在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的遗传元件(又称载体)中, 形成重组的DNA分子, 并在宿主细胞中增殖。这种复制基因或DNA片段以产生相同DNA分子“拷贝”的技术，称为重组DNA技术或DNA克隆。又称分子克隆、基因克隆、基因工程或遗传工程。 一、工具酶在重组DNA技术中具有特殊的用途 限制性内切核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）构建重组DNA分子还需要其他工具酶 碱性磷酸酶能去除DNA分子的5?-磷酸基 DNA聚合酶和核酸外切酶用于修剪限制性片段的末端 脱氧核苷末端转移酶用于DNA分子加尾以构成粘性末端 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 应有高的拷贝数。 三、宿主细胞为重组的DNA分子提供扩增 、筛选和表达的场所 第 三 节DNA 克 隆 DNA Cloning 一、DNA克隆的核心过程是构建重组DNA分子 1. 根据目的选择适宜的克隆策略 2. 通过限制性内切酶水解载体及外源片段产生配伍末端 （1）限制酶水解载体使成为线性分子 （2）根据目的选择外源DNA的来源 （3）限制性内切酶水解外源DNA片段以产生与载体配伍的末端 3．DNA连接酶将载体 DNA与外源DNA连接 (1) 粘端连接 (2) 平端连接 (3) 同聚物加尾连接 (4) 人工接头(linker)连接 （二）重组分子可通过扩增、筛选与分离鉴定而获得 1. 将重组DNA导入宿主细胞有转化、转染和感染几种方法 ① 将外源DNA转入细菌的过程称转化(transformation) ② 将外源 DNA直接转入动物细胞的过程称转染 (transfection) ③ 采用包装病毒将外源DNA转入细胞的过程称感染 (infection) 2．标志筛选和序列分析可用于重组子的筛选和鉴定 （1）质粒的抗性基因是转化菌的筛选标志 （2）用插入失活筛选重组子 （3）标志补救(marker rescue)是筛选转化酵母的常用方法 （4）限制性图谱和核酸序列分析可直接鉴定外源 DNA 二、利用重组DNA技术可分离、克隆单个基因 （一）候选基因有染色体DNA和cDNA两种来源 待克隆DNA的来源可以是染色体DNA，也可以是cDNA。这需根据实验目的进行选择。如果对蛋白质的氨基酸序列感兴趣则采用cDNA为来源的克隆策略。如果对基因的表达调控或编码区的间隔序列感兴趣，则选择基因组DNA克隆的策略。 可以通过构建基因组DNA文库(genomic DNA library)或 cDNA文库(cDNA library)来克隆目的基因。 （四）某些转录因子的编码基因可通过特异杂交系统被克隆 酵母单杂交系统用于DNA结合蛋白的基因克隆 酵母双杂交系统用于特异性相互作用蛋白质的基因克隆 第 四 节克隆DNA的相关分析Analysis of Cloned DNA 第 五 节重组DNA技术在生物学及医学中的应用 Applications of Recombinant DNA Technology in Biology and Medicine 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 一、通过限制性作图初步了解DNA的序列信息 二、DNA测序是了解DNA序列信息最首要的工作 三、利用生物信息学技术对已测定的序列信息进行分析、综合和储存 （一）确定克隆的开放阅读框可了解编码蛋白质的信息 （二）利用计算机程序确定外显子/内含子边界 （三）通过数据库搜索确定启动子和转录因子结合位点 （四）通过数据库搜索确定蛋白质基序和结构域 （五）应用网络序列比对搜索工具进行核苷酸和/或蛋白质序列比对 四、分子杂交与印迹技术检测特异基因的存在或表达 （一）Sou