生化研究技术要点详解.pptVIP

5）多酚、醌类物质对蛋白质提取影响及解决办法 多酚最具特征性的反应之一与蛋白结合产生沉淀 蛋白质-多酚的结合作用是通过在蛋白质表面形成多配位键(包括疏水作用和氢键),使分离的蛋白质产生交联 蛋白质-多酚的结合是可逆的,受多种因素:蛋白质结构、蛋白质和单宁的浓度、溶剂成分、离子强度、pH值和其他物质,如多糖等的影响 高pH值环境或有机溶剂都会减少多酚与蛋白质的结合 醌类物质与蛋白质的氨基和巯基反应,导致蛋白质失活,并加剧蛋白质沉淀 PVPP具有类似蛋白质的内酰胺结构,具有较强的生物相容性和极性,可以通过其内酰胺结构中的N原子和O原子与多酚形成氢键,从而吸附多酚或醌并使其从溶液中沉淀下来 富含多酚的种子中蛋白质提取 盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度％ 中国农业科学院研究生院 3）：抑制剂 EDTA；柠檬酸；草酸；有机溶剂；偏低或偏高pH;蛋白酶抑制剂 胰岛素－糜蛋白酶降解严重，提取用68％酒精溶液并用草酸调pH至2.5—3.0 蛋白水解酶抑制剂-二异丙基氟磷酸、碘乙酸等 中国农业科学院研究生院 4）其他 中国农业科学院研究生院 中国农业科学院研究生院 中国农业科学院研究生院 6）：1－10％乙醇；1－5％的（甘油、PEG、聚蔗糖、蔗糖、葡萄糖） 7）：提取缓冲液pH a: pH 中性； b: pH 3－6; 9-11破坏所分离的蛋白质与其他杂质的静电结合； c：碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液来进行提取。（前者如cytC、后者如3－磷酸甘油酸脱氢酶） d：3；防止蛋白酶活性；动物内脏组织防止酶原激活 8）：缓冲液用量－ 鲜组织 ----2倍以上，以4－5倍为合适 干组织 ----10倍 中国农业科学院研究生院 中国农业科学院研究生院 5、特殊蛋白提取 1）：脂蛋白 （脂质结合牢固）； 分子中非极性侧链多的蛋白质 ；不溶于水、稀盐、稀酸和稀碱 有亲脂性和亲水性的有机溶剂－丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等提取。 在水和脂分子间起着类似去污剂的桥梁作用，取代蛋白质与脂质的结合位置，阻止脱落了的脂质重新与蛋白质结合。增加蛋白质在水中的溶解度。 低温下操作 丁醇解离脂蛋白的能力最强 丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强； 兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。 丁醇提取法的pH及温度选择范围较广 琥珀酸脱氢酶、碱性磷酸酯酶的提取－－正丁醇 （线粒体等含脂高的微膜体系中蛋白） 中国农业科学院研究生院 2）：膜蛋白－外周、内在蛋白 与膜成份结合较牢或属于膜组成的蛋白质 －超声波，去污剂或其他比较强烈的化学处理 常用方法： a：浓盐或尿素等溶液提取：如NaCL04、尿素、胍盐，浓度2M－提取27％ b：碱溶液提取：在pH 8一11范围内，膜蛋白随着pH值的提高而溶解度大大增加，pH l1溶出40一50％的膜蛋白 c： 金属整合剂－适用通过金属离子与膜成份结合的膜蛋白质 EDTA提取膜ATP酶的偶联因子；EDTA＋超声波抽提膜磷酰转移酶 d：有机溶剂抽提：乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇、丙酮粉等 冷丙酮制成的丙酮粉－抽提膜上脂蛋白或膜内脂蛋白组份 叔戊醇及正丁醇用于膜内脂蛋白 正丁醇可在广泛的pH值(PH 3—10)和温度范围内(一2一十40)使用 实例：NADPH脱氢酶， 琥珀酸脱氢酶 细胞色素