狄尔斯阿尔德反应和点击化学组合的双色聚糖标记活细胞要点.docVIP

狄尔斯阿尔德反应和点击化学组合的双色聚糖标记活细胞 蛋白质糖基化是一种复杂的形式,他是翻译后的修改并且对于很多蛋白质显示了重要的功能。唾液酸被显著的放置在糖蛋白膜外的结尾处。它对于大量的细胞功能有着重要的作用并形成了一种细胞的保护膜。此外，它不断与环境的细胞作用,并有助于组织相容性。使得唾液酸化作用成为了人们感兴趣的领域,但是监测人体内的唾液酸是一种挑战.当蛋白质通常用基因的方法标记,比如表现为GFP融合蛋白,类似的方法并不能得到第二次基因产物,比如唐聚合物的多聚.低聚糖新陈代谢工程是一种成功的战略来显示多聚糖在试管外和试管内的位置.用这种方法,细胞被培养在非天然单聚糖衍生物中,携带一个信息集团,被细胞生物机械所接受.例如, Ac4ManNAz被细胞接纳,通过细胞酯酶脱去乙酰基.由于唾液酸生物合成酶的混乱,使他转变为了N-叠氮乙酰基甘露糖安丙酮酸并被唾液多糖共轭物所吸纳融合.一旦呈现在细胞表面, azide-containing sialylated glycan将会通过生物正交连接反应被看到.另外, Ac4ManNAz的单糖衍生物,N-乙酰半乳糖胺,N-乙酰氨基葡萄糖,和L-海藻糖适合于MOE,为细胞结构规则和多糖在细胞中的功能提供了更深刻的见解. 当前,主要是施丁陶格配体和叠氮-炔[3+2]环加成(Cu催化或者增大张力，也就是常说的click反应)被应用于MOE配体研究.然而，他们都依赖于叠氮的反应，因此不能用于两种不同的被包含的代谢的糖类的同时监测。一种标记策略在叠氮和炔烃存在的条件下被实施，显著的扩大了化学标记反应在活细胞中的范围，并得到了比较满意的结果。 近期，资料表明，翻转电子的D-A反应，1,2,4,5-四嗪和有张力的亲二双烯体，比如，反式环辛烯，环丁烯，降冰片烯，环辛炔，取代的环丙烯实现了生物正交配体反应的要求，以及叠氮和炔正交环加成反应。然而，环炔烃或者动力学四嗪被期望通过唾液酸生物合成途径从类似的N-酰基甘露糖胺衍生物很有效的实现新陈代谢。为了研究更小的实现MOE的亲二双烯体，我们把末端单取代炔作为新的化学报道的类型。我们最近报道了末端炔烃和1,2,4,5-四嗪D-A反应在碳水化合物微数列准备的成功应用。事实上，末端炔烃很难在生物体中被发现，在蛋白质的完全缺席使他成为了有前途的信息基团。于此,我们所显示的ManNAc的衍生物所包含的末端炔烃在酰基侧链中是代谢的被并入细胞表面的唾液酸中,随后被D-A反应标记（图1）。而且，我们展示了两种不同修改的双重标记，被代谢并入的单糖可能会被D-A反应和大张力的叠氮-炔环加成反应结合。 末端烯烃和四嗪的耦合已经显示出了较高的产率,我们研究了这种配体反应的动力学.研究表明 DARinv反应在水中比在有机溶剂中反映的快得多.因此,我们附上了tri(ethylene glycol)连接体来获得水溶性的四嗪11.使用11和ManNPtl (1) and ManNHxl 反应定量的测量了动力学, pentenoyl的二阶反应常数为0.021 Lmol_1 s_1,己烯酰基化合物的二阶反应常数是0.041 Lmol-1 s-1.尽管遇有张力 图1. MOE作为化学信息集团用于末端炔烃的战略 直链烯烃和四嗪的反应速率对于位阻现象是非常敏感的，双键和更多取代基的很慢。另一方面，末端炔烃可以在没有激活物的情况下快速反应。这引起了我们从甘露糖铵盐中用三步设计甘露糖胺2和4的合成。在Keppler et al.的工作基础上，我们期望两种衍生物都被接受通过细胞用N-pentenoylmannosamine（2）（由于它较短的酰基侧链）以更高的效率被并入。另一方面，甘露糖胺衍生物4姬郗酰基侧链被期望在D-ARinv反应中更快，由于它的双键和缺电子酰基距离很远。 作为炔属系的另一个反应物，我们选择了一个双芳基四嗪，因为这些混合物先前显示出了足够的稳定性而不会水解，而这是生物正交化学的重要的先决条件。在模型反应中，pentenamide 7与四嗪8在DMSO中反应，得到dihydropyridazines 9a/b，9以两种互变异构体的形式存在，他们有等量的产率（计划1和支持信息）。液相色谱-质谱仪联用分析显示产物很容易被氧化为哒嗪类10a/b。为了完成这种转变，我们让9a/b与异戊基亚硝酸盐反应得到哒嗪类10a/b,通过柱层析净化后产率为78%。 已经显示出末端烯烃和一个的四嗪之间的耦合反应的优良率，我们研究了连接反应的动力学。已知的，该DARinv反应在水中比在有机溶剂快得多。因此，我们安装了三（乙二醇）链接器获得水溶性四嗪11（图3）。使用11和ManNPtl (1) and ManNHxl反应，可以进行定量动力学测量. 戊烯的二阶速率常数被确定为0.021Lmol-1s-1, 己烯化合物