功效成分检测方法.doc

粗多糖测定方法 第一法 本方法参照《保健食品功效成分检测方法》（王光亚、白鸿主编）中“粗多糖的苯酚-硫酸分光光度测定法”的方法测定。 主要仪器 离心机：4000r/min 离心管：50ml 分光光度计 水浴锅 漩涡混合器 试剂 实验用水为双蒸水，所用试剂为分析纯级。 无水乙醇 80%（V/V）乙醇溶液 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的分析葡萄糖0.5000g加水溶解，并定容至50ml，此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀释100倍为使用液（0.1mg/ml）。 5%苯酚溶液（W/V）：称取精制苯酚5.0g,加水溶解并稀释至100ml，混匀。溶液置于冰箱中可保存一个月。 浓硫酸（比重1.84）。 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.5）：31.5ml（0.2mol/L）磷酸氢二钠与68.5ml（0.2mol/L）磷酸二氢钠混合。 测定步骤 样品提取：称取混合均匀的固体样品1.0~2.0g，置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴中加热1小时，冷却至室温后补加水至刻度（V1）。取50ml上述提取液置于100ml具塞锥形瓶中，加1ml 10%淀粉酶液和0.5ml 0.2M磷酸盐缓冲液，加塞，置55℃~60℃酶解1小时，再加约为样品体积1%的葡萄糖苷酶于60℃以下再水解1小时候取出（用碘液检验是否水解完全，如不完全可延长水解时间至酶解液加碘液不变蓝色为止），于电炉上小心加热至沸腾做灭酶处理，冷却至室温，定容至100ml，过滤，取滤液沉淀粗多糖。 沉淀粗多糖：准确吸取上述滤液5.0ml（V2），置于50ml离心管中，加入无水乙醇20ml，混匀，与4℃冰箱静置4小时以上，以4000r/min 离心5min，弃去上清液，残渣用80%（V/V）乙醇数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至10~25ml（V3）（根据糖浓度而定），供测定用。 标准曲线的绘制：准确吸取葡萄糖标准使用液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml（相当于葡萄糖0mg、0.01mg、0.02mg、0.04mg、0，06mg、0.08mg、0.10mg）置于25ml比色管中，补加水至2.0ml，加入5%苯酚溶液1.0ml，在旋涡混合器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，在旋涡混合器上小心混匀，置沸水浴中2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 样品测定：准确吸取样品测定液适量（V4）（含糖0.02~0.08mg）置于25ml比色管中，补加水至2.0ml，然后按（3）法测定吸光度值。从标准曲线上查出葡萄糖含量，计算样品中粗多糖含量。 结果计算 m1×V1×V3 X= ×0.9×100 m2×V2×V4 式中 X——样品中粗多糖含量[mg/100g(ml)]； m1——样品测定液中葡萄糖的质量（mg）； m2——样品质量（g或ml）； V1——样品提取液总体积（ml）； V2——沉淀粗多糖所用样品提取液体积（ml）； V3——粗多糖溶液体积（ml）； V4——测定用样品液体积（ml）； 0.9——葡萄糖换算为粗多糖的系数。 第二法 按《保健食品功效成分检测方法》（王光亚、白鸿主编）中“葡聚糖的分光光度测定法”的方法测定。本方法适用于各类食品中以葡聚糖为主要结构，相对分子质量10000以上的水溶性粗多糖的测定。本法最低检出限为5.0mg/L。 方法提要 食品中相对分子质量大于1×104的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚—硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算食品中粗多糖的含量。 主要仪器 1）分光光度计 2）离心机（3000r/min） 3）旋涡混合器 试剂 本方法所用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。 乙醇溶液（80%）：200ml水中加入无水乙醇80ml，混匀。 氢氧化钠溶液（100g/L）：称取100g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。加入固体无水 硫酸钠至饱和，备用。 铜试剂储备液：称取3.0g五水硫酸铜，30.0g枸橼酸钠，加水溶解并稀释至1L，混匀，备用。 铜试剂溶液：取铜试剂储备液50ml，加水50ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。 洗涤剂：取水50ml，加入10ml铜试剂溶液、50ml氢氧化钠溶液，混匀。 硫酸溶液（10%）：取100m