第四章分子标记技术及其在海洋生物研究中的应用教案解析.ppt

PCR技术的主要类型 ㈠ 巢式PCR ㈥ 彩色PCR ㈡ 多重PCR ㈦ 原位PCR ㈢ 不对称PCR ㈧ 定量PCR ㈣ 锚定PCR ㈨ 差异显示PCR ㈤ 反向PCR ㈩ 重组PCR procedures template(DNA or RNA), primers, Taq enzyme, 10×PCR buffer, Mg++, 5mmol/L dNTPs pre-denaturation--denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30 分子标记的概念 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳： 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。 分子标记的种类 分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括： 限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）； DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； 原位杂交（in situ hybridization）等； 第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包括： 随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； 简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； 扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； 序标位点（Sequence tagged sites, 简称STS标记）； 序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等； 第三类是一些新型的分子标记，如： 单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。 分子标记的特点 （1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。 几种分子标记 （一）限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 该技术由Grodzicker等于1974年创立。 特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。 EcoRⅠ酶切示意图 5’ AGGAATTCGAATTCGAATTCCG 3’3’ TCCTTAAGCTTAAGCTTAAGGC 5’ AGG AATTCG AATTCG AATTCCG TCCTTAA GCTTAA GCTTAA GGC RFLP标记的主要特点有： （1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的； （2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制； （3）共显性，可区分纯合子和杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。 （ 二） 随机扩增多态性DNA标记(RAPD) 由Williams等于1990年创立。 RAPD标记技术