一、蛋白质的稳定性研究的意义.pptVIP

讨论： 1、酶蛋白活性来源？ 2、酶蛋白活性为什么不稳定？ 3、强化酶蛋白稳定性的措施？ 一、蛋白质的稳定性研究的意义 稳定性：不仅取决于外界环境因素，更取决于蛋白质内存性质。 ① 了解蛋白质分子自我装配过程； ② 从已知氨基酸序列预测分子空间结构； ③ 了解酶蛋白使用性能及稳定化要求; ④ 生产满足使用要求的稳定的酶制剂。 二、稳定蛋白质空间结构的作用因子 （1）配体的结合作用 金属离子：结合到多肽链的不稳定部分(特别是弯曲处)，可增加蛋白质的稳定性。 底物、辅因子和其他低相对分子质量配体与酶相互作用：使蛋白质发生构象变化，使其构象更稳定。 2）蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 蛋白质分子表面上疏水簇与水的接触不利于蛋白质的稳定性。 蛋白质与脂类或多糖相互作用形成复合物时，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，有利于蛋白质的稳定。 （3）盐桥和氢键 蛋白质中盐桥的数目虽少，但对蛋白质稳定性的作用很显著。氢键：是维持二级结构（如α-螺旋、β-片层、β-转角等）的重要化学键。但对蛋白质结构稳定性无特别作用。 （4）二硫键 蛋白质中形成二硫键，分子内交联可增强其坚实性，伸展蛋白质的熵急剧降低，这个稳定化效应值随着肽链中氨基酸数目的增加而增加。 （5）对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 结构上重要的氨基酸残基(如活性部位氨基酸)的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。 如：半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感。 （6）氨基酸残基的坚实装配 蛋白质球体积大约25％常为水分子所充满，极性水分子与球体疏水核接触会导致蛋白质不稳定。 随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得更坚实，蛋白质的稳定性也增加。 （ 7）疏水相互作用 水相中蛋白结构内部的带有非极性侧链的氨基酸与水的接触，会使水的结构有序地排列形成了五角形的原子簇，引起熵的降低和蛋白质折叠状态的改变。 非极性氨基酸残基数越多和暴露于溶剂的非极性氨基酸残基数越少，蛋白质越稳定。 三、蛋白质稳定性的测定 酶的稳定性 蛋白质变性 在一定的环境下，维持活性蛋白质结构的非共价力消失，引起分子部分伸展破坏了活性部位，造成分子失活。 酶分子的不可逆失活示意图 测定蛋白质构象稳定性方法 (1)测量或比较稳定性标准量 熔化温度Tm（受热伸展过渡中点时的温度）、蛋白质自由能、最大稳定性温度TS和特定温度下蛋白质活性维持时间。 （2）测定方法 ①N（天然折叠蛋白质）→U（变性伸展蛋白质）：测定两种状态下的△G（不同变性剂下的△G（H2O）或不同温度下△G（25℃）） ②酶活测定法：4℃作参比，定期分别测定不同温度下的酶活力，算出失活反应常数，比较不同蛋白质（酶）的反应活化能。（测定过程必须是一级反应） 四、蛋白质不可逆失活的机理 1、蛋白水解酶和自溶作用 外源蛋白水解酶作用催化肽键水解的结果。 2、聚合作用（与沉淀反应有本质区别） N U A As N U：可逆伸展（构象变化，疏水基暴露） U A：聚合蛋白质（蛋白质分子相缔合） A As：发生二硫交换反应的蛋白质聚合 （有可能会再活化） 3、极端pH ①由于远离蛋白质等电点，分子内部相同电荷的静电斥力，导致蛋白质伸展； ②蛋白质伸展后内部基团的电离，导致不可逆失活； ③肽键的水解； ④二硫键的破坏。 4、氧化作用 带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基易被多种氧化剂氧化（如分子氧、过氧化氢、氧自由基等） 5、表面活性剂和去污剂 溶解：单体 气液界面：单层 达到临界胶束浓度，缔合成稳定的胶束。 6、变性剂 （1）脲（8-10mol/L)和盐酸胍(6mol/L) 可与蛋白质氨基和巯基作用，消除维持三级结构的疏水作用，引起不可逆失活； （2）高浓度盐 对蛋白质既可起稳定作用，也可起变性作用。 促变序列（稳定蛋白作用由强至弱）（CH3)4N+NH3+K+,Na+Mg2+Ca2+Ba2+SO42-CL-Br-CLO4-SCN- 稳定机理：增加离子强度、降低疏水基团溶解、加强蛋白周围水化层。 不稳定机理：与蛋白质带电基团或肽键结合，降低水化层。 （3）螯合 结合金属离子的试剂，如EDTA能与金属离子形成配位复合物，使金属酶失去金属辅因子而失活。通常是不可逆的。有时螯合又可起稳定有害金属离子的作用，使酶不可逆失活。 （4）有机溶剂 通过疏水作用改变溶液的介电常数，影响维持构象的非共价力的平衡，形成结构“外翻”的倾向。 有机溶剂也有从蛋白质分子表面夺水的作用。 7、