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免疫学检测技术 胶体金试纸条诊断技术 一、简 介 胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。 一、简 介 胶体金（Colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。 一、简 介 胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合。 胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术 二、胶体金试纸条诊断技术的原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。 胶体金快速诊断技术的特点 简捷快速：操作简单，一般只要5-10min 就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR 需要时间更长。 结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。 特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。 胶体金快速诊断技术的应用 病毒性疾病：传染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬细小病毒、猪瘟等。 寄生虫疾病：血吸虫病、旋毛虫病、囊虫病、恙虫病。 细菌性疾病：霍乱弧菌、类鼻疽。 ELISA测定方法 1、 加样 2、 保温 3、 洗涤 4、 比色 5、 结果判定 封闭 P330 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的操作与包被相类似。 最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，可以高浓度使用（5%）。 采用酶标法（ELISA）进行三聚氰胺检测 Thermo MK3型酶标仪 酶标仪原理与结构 ELISA法检测肠毒素 胶体金试纸条示意图 检测线 质检线 吸收垫 样品垫 硝酸纤维素膜 连接垫 （胶体金垫） 背衬 （底板） 测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。 测 定 测 定 过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。 测 定 阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。 * * 抗原或抗体检测原理： 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。 Equivalence – Lattice formation 抗原和抗体可以发生高度专一性的结合 抗原或抗体检测原理 一种细菌可以刺激多少种抗体产生？ 根据抗原的化学性质分： 天然抗原：微生物及其产物抗原如 菌体抗原（O 抗原） 鞭毛抗原（H 抗原） 表面抗原（如大肠杆菌的K 抗原） 细菌的毒素抗原 病毒抗原（V 抗原） 人工抗原：人工合成多肽、蛋白等 抗体（Antibody) 注射 抗原（如类毒素） 血清 抗体？ 抗原？ 抗体的制备 一、凝聚反应(Agglutination) 二、沉淀反应 1、溶液中的沉淀反应 2、凝胶扩散沉淀 3、免疫电泳 血清免疫电泳 火箭电泳 对流免疫电泳 三、补体参与的反应 四、免疫标记的抗原抗体技术 酶联免疫吸附（ELISA） 抗原抗体检测方法 一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。 一、凝集反应 二、沉淀反应 当抗原是可溶性分子时，与抗体结合则形成沉淀。 1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下37度保温1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻