大学微生物遗传与育种实验2015教案分析.ppt

微生物遗传与育种实验 师 亮 生科楼C5014 TellEmail：shiliang@njau.edu.cn 教学目的 掌握微生物遗传与育种的相关研究技术：诱变、杂交、转化、性状检测、遗传分析等 将遗传学知识与育种技术相结合，达到具备独立进行遗传学实验设计、微生物育种技术路线设计与现代微生物分子遗传技术操作能力的目标。 实验假说 多糖：是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。 纤维素、几丁质：可构成植物或动物骨架 淀粉、糖原：可作为生物体储存能量的物质 生物活性：免疫调节、抗病毒、抗癌、降血糖 酵母多糖——优质免疫多糖、优质功能膳食纤维 根瘤菌多糖——根瘤菌能产生胞外多糖(EPS)、荚膜多糖(KPS)、脂多糖(LPS)和环状葡聚糖四种多糖类物质。 根瘤菌的EPS能够富集环境中营养元素的功能，另外，对于共生固氮过程具有重要作用 基因突变及其机制 突变 自发突变 诱发突变 环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9 。 某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。  转座子——常用的一种诱变因子，它们在基因组的任何部位插入，一旦插入某基因的编码序列，就引起该基因的失活而导致中断突变， 由于转座因子Tn5带有可选择标记(抗生素抗性)，因此可容易地分离到所需的突变基因。 实验内容 多糖产生菌突变株的筛选和鉴定 根瘤菌多糖产量测定 根瘤菌抗生素抗性检测 两亲本杂交 杂交子筛选和鉴定 材料 菌种：根瘤菌W33、E.coli （ pSC123, miniTn5，Knr） 抗生素：卡那霉素，四环素，利福霉素，95%酒精 培养基： （1）TY培养基（培养根瘤菌 （2）蔗糖酵母膏培养基（筛选根瘤菌） （3）LB培养基： 仪器： 技术路线 杂交子鉴定 两亲本杂交 杂交子筛选 E.coli （miniTn5，Knr） 多糖含量测定 出发菌株抗性测定 出发菌株选择 二、实验原理 1. 培养基：用于培养微生物的基质 （简单描述） （碳源、氮源、矿物质、生长因子、微量元素、水） 培养基的种类： 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 固体、液体、半固体 基础培养基、加富培养基、选择性培养基 （Synthetic Dropout) 2. 无菌技术：使用物理（机械）或化学的方法将微生物杀死的技术 三、实验内容 TY培养基（根瘤菌） LB培养基（大肠杆菌） 甘露醇酵母膏培养基（根瘤菌） TY培养基 1. 培养基的配制 液体 固体 2. 无菌水的制备 实验基本流程 设计、计算、准备 原料称量、溶解 调节pH 分装 （培养基不要碰到试管口） 塞棉塞/扎口 玻璃器皿的包扎灭菌 （培养皿、试管、移液管） 灭菌 试管中的固体培养基（摆斜面） 四、实验步骤 TY培养基 胰蛋白胨5.0 g，酵母粉3.0 g，CaCl2 0.3 g，水1000 mL，（固体培养基琼脂2%），pH 7.0。 1 根瘤菌抗性检测用：1000 mL，固体（500 mL*2） 2 双亲杂交用：1000 mlL，固体（500 mL*2） 3 生物膜用：试管3 mL*10个*15组 液体 甘露醇酵母膏培养基 甘露醇1%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.01%，硫酸镁 0.02%，酵母粉0.1%，刚果红（0.4%）10 mL，（固体培养基琼脂2%），pH 7.0-7.5。 4 多糖测定：100 mL/250 mL三角瓶，共4瓶。液体 固体培养基： 5、6、7 200 mL/500 mL三角瓶，每组1瓶，共15+1瓶（双抗+无抗） 8 500 mL/1 L三角瓶，共2+1瓶 9 200 mL/500 mL三角瓶，共2+1瓶 10 复筛用，5 mL*（2+1）*3*15。 液体 其他无菌材料 11 无菌滤膜：0.22 μm 滤膜：300 片；水浸湿，15 片/平板（盖、底都放），计20个平板 12 无菌牙签：200根牙签（50*4） 2 mL无菌离心管：50个/盒*2 13 无菌水：100 mL/250 mL三角瓶*10 一、根瘤菌多糖产量测定（硫酸蒽酮法） 菌液制备： 胞外多糖的提取 胞外多糖的测定--蒽酮比色法 发酵液 取1ml上清液 弃上清，取沉淀 5000 rpm离心10 min 加3倍体积无水乙醇，4℃沉淀2 h， 5000 rpm离心15 min 加1ml无水乙醇洗涤沉淀， 重溶于去离子水， 加0.5倍体积氯仿：正丁醇(5:2)， 震荡，离心，反复多次， 至无白色沉淀产生 取1 ml上层清液（多糖溶液） 用于测定多糖含量 胞外多糖的提取 管号 操作