分离技术课件.pptVIP

二.下游加工过程的特点： 1. 培养液中生物活性成分的含量很低，组成复杂，杂质含量较高，需要几步分离，每步应达到收率为90%。这样，总收率也不高。 2. 生物活性物质不稳定，条件的变化，容易引起失活，或者分解。这些条件包括：酸碱度，温度，有机试剂，金属离子，处理过程中的剪切力。 3. 发酵过程条件不均一，要根据不同的工艺条件采取略有不同的处理方法。处理原则为：时间短，温度低，酸碱度适宜，勤洗消毒。 4. 对基因产品，应注意安全生问题。不应有任何菌体的扩散。 五.常有的分析鉴定方法 1.物理分析法—密度与相对密度法，折光法；旋光法,熔点测定等 2.化学分析法—各种滴定法 3.光学分析法—紫外可见法；荧光法，原子吸收法 4.色谱法—高效液相色谱法，气相色谱法；薄层色谱法 5电泳法和高效毛细管电泳法 6.生物检定法 也称作生物鉴定及生物检验：是用以测定某生物或生物性材料对外来化合物的刺激之反应，藉以定性测试该化学药剂是否具有活性，或定量地测定适当的药量。生物检定法是生物学、医学、特别是毒理学的重要内容和基础，在研究新药的过程中，生物检定法起了关键性的作用。 第四章离子交换分离原理 离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。 （一）离子交换剂： 惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。 骨架+活性集团+可交换离子 惰性不溶性载体+功能集团+平衡离子 惰性骨架：苯乙烯骨架，二乙烯苯（胶联剂） 聚丙烯酸，纤维素类，聚葡糖类，大孔树脂等 第六章 亲和层析分离 一亲和层析：利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲核层析。） 固定相组成：载体+配体 载体：与配基结合的层析介质 配体：在亲和层析中起可逆结合的特异性物质，也称为配基 如酶与底物、抗体与抗原、激素与受体、核酸中的互补链 亲和层析的应用 1） 抗原和抗体? 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。 抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为10–8 - 10–12 M，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。 2 激素和受体蛋白? 激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（10-6－10–12 M）而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。 3 凝集素和糖蛋白? 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。 用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。 伴刀豆球蛋白A能结合含α-D-吡喃甘露糖苷或α -D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。 麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。 洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。 4）多核苷酸和核酸? 利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。 以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。 5）辅酶? 核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。 例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。 金属螯合层析 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。 金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离 第七章沉淀法分离原理 沉淀分离法： 改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶；析出物为无定形固体称为沉淀法。固相析出法主要有盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。 一.盐析法 利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 等电点沉淀实例 ①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于p