ChapterⅢ菌种保藏原理与方法精要.pptVIP

* * 1）暂时保藏法——斜面保藏 方法：斜面置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 优点：适用于各种微生物、简便易行、易 于观察； 缺点：保藏时间短、传代频、易退化、易 污染、工作量大。 改良方法：橡皮塞取代棉塞、加矿油 2）长期保藏法 原理：运用干燥、低温和隔绝空气等手段，降低 微生物菌种的新陈代谢速率，使菌种的生 命活动处于半永久性的休眠状态，以达到 长期保存的目的。 方法： 砂土管法 真空冷冻干燥法 液氮法 1）砂土管法： 干法：（适用于部分真菌、放线菌）将斜面上 孢子刮下，接种于无菌砂土管中（砂 装试管2/5)，搅拌均匀。 湿法：斜面中加3~5ml无菌水制成菌悬液，取菌 悬液10滴加入砂土管，以管内砂全部湿 润为宜。 将砂土管置于干燥器中真空干燥，低温或室温下保藏 适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏。 保藏时间几至几十年。 2）真空冷冻干燥法 3)液氮超低温保藏法： * * ④真空冷冻干燥法 在干燥的条件下又保持真空来保藏菌种。 原理：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥， 使微生物细胞处于半永久的休眠状态，以达到长 久保藏的目的。 方法：用无菌脱脂牛奶作保护剂，加入3ml于斜面中制成 菌悬液，分装在安瓿中速冻真空干燥。 真空度维持在0.1~0.3mmHg,悬液维持冻结状， 水分不断升华，至菌体混合物呈疏松状，熔封。 优点：适用于各种微生物；便于大量保藏；可避免污染， 菌种存活时间长（几到几十年） 缺点：手续繁琐。 ⑤液氮超低温保藏法 方法：用10%甘油、二甲亚砜或蔗糖和吐温80 作保护剂，将菌种分散于其中，或将长 菌的琼脂块放入保护剂中，熔封后迅速 降温至-35℃。预冻后保存在液氮超低温 冰箱中（ -196℃）。 优点：适用于各种微生物的较理想的保藏方法 缺点：需专门设备 使用时速融，30 ~40℃水浴摇动，融后 以无菌手续开启 Chapter Ⅲ 菌种的复壮与保藏方法 第一节 菌种的衰退与复壮 一、衰退的原因： 衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 1、基因突变 核基因突变 质粒脱落 （根本原因） 2、连续移代 （加速退化的直接原因） 3、培养和保藏条件的影响 常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降； 防止菌种衰退的方法： ①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；  ②选择合适的培养条件；  ③采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；  ④采用有效的菌种保藏方法。 二、衰退的防止 三、菌种的复壮 菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种 菌种的复壮措施：①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。④采用有效的菌种保藏方法。 第二节 工业微生物菌种的保藏 一、目的：①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种二、原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代