分子生物学第四章--基因工程常用工具酶资料讲解.ppt

部分消化和完全消化 构建载体时，若目的基因内部存在与多克隆位点相同酶切位点时，可以考虑使用部分酶切 * 常用限制性核酸内切酶的特性 微生物名称 酶名称 识别顺序 同裂酶 同尾酶 Bacillus amyloliquefaciens H 解淀粉芽孢杆菌 BamHⅠ GGATCC BstⅠ Bgl Ⅱ MboⅠ Bacillius globigil 球芽孢杆菌 Bgl Ⅱ ACATCT Escherichia coli RY13 大肠杆菌 EcoRⅠ GAATTC Haemophilus influenzae 流感嗜血菌 Hind Ⅲ AAGCTT HsuⅠ Providencia stuartii 164 普罗威登细菌 PstⅠ CTGCAG SalpⅠ Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链球菌 SalⅠ GTCGAC AvaⅠ XhoⅠ * (1)限制性内切酶能够识别和切割单链DNA，例如有些酶能够识别和切割非回文序列，但这种酶在基因工程应用不够广泛 限制性内切酶能否切割单链？ (2)基因工程中的限制性内切酶主要是识别和 切割双链DNA，因为大多数限制内切酶是以 二聚体的形式与DNA结合，酶与DNA形成稳定 的化合物，产生反应，也有部分酶是以单体 的形式与DNA结合 * 第二节 DNA连接酶------ “分子缝合针” DNA连接酶（DNA Ligase）： 催化两条DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。例如:T4 DNA连接酶。 * 外源基因与载体的连接方式： （1）粘性末端连接 方式：① 同一限制性内切酶切点的连接 ②不同限制性内切酶切点的连接 * （2）平端连接 适用于：① 限制性内切酶作用产生的平端 ② 粘端经特殊酶处理变为平端 * （3）同聚物加尾连接 由末端转移酶（Terminal transferase）作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。 * （4）人工接头 平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。 * 第三节 其它工具酶 修补工具酶 DNA聚合酶I 可被枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解为2个片段，其中带有C末端的大片段叫DNA聚合酶I 大片段（Klenow片段）。它具有5’——3’聚合酶活性或3’--5’外切酶活性。而N端小片段只具有5’--3’ 外切酶活性。 * Klenow大片段----补平或标记限制酶切割产生的3’凹端，例 5’----TTCGGACTACG--------3 ’ 3’----AAGCCTGATGCCAT---5 ’ T4 噬菌体DNA 聚合酶 具有5’--3’聚合酶活性或3’--5’外切酶活性。 其3’--5’外切酶活性比Klenow片段强200倍。 * 末端加工酶 S1核酸酶， 碱性磷酸单脂酶 末端转移酶 催化DNA链的3’-OH端加脱氧核糖核苷酸(dNTP)的聚合反应，使载体和待克隆基因接上互补的同聚体尾部（人工加polyA 或polyT 尾） 反转录酶(用原核系统表达具内含子的真核基因) * 去磷酸化酶： 载体去磷酸化防治自身环化 核酸酶S1 用途： 1. 除去双链DNA的粘性末端以产生 平末端； 2. 除去cDNA合成时形成的发夹结构； 3. 分析RNA的茎环结构以及DNA- RNA分子的杂交情况等。 * 功能： 催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。 底物是单链DNA或有3′突出末端的 双链 DNA。 OH 5′ 3′ Mg2+ dNTP 5′ 3′ (A、G、C、T)n nppi 5′ 3′ OH Mg2+ dNTP nppi 5′ 3′ (A、G、C、T)n * 2.底物是平端或3′ 凹端的双链DNA。 5′ 3′ Co2+ dNTP 5′ 3′ (A、G、C、T)n nppi 5′ 3′ Co2+ dNTP nppi 5′ 3′ OH OH (A、G、C、T)n * 用途： 1. 主要作用是在载体或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。 2. DNA 3′末端的同位素标记。 * 实验中经常遇到的问题 酶切不开 连接失败 * 酶切不开的原因 DNA纯化不理想，存在酶的抑制剂 反应体系不合理，缓冲液使用错误 用酶量偏大，甘油浓度太高 酶失活 温度不合理 * 连接失败 原因： (1)目的片段与载体的摩尔比例