1氨基酸分离---纸层析法.ppt

生物化学实验 张积森 （zjisen@)  生物化学(Biochemistry)：研究生命物质的化学组成、结构及生命活动过程中各种化学变化的基础生命科学. 化学生物学（Chemical Biology)：利用化学手段研究生物学问题或利用生物学手段解决化学问题. Introduction Biochemistry Chemistry Biology Genetics Molecular Biology Biotechnology Pharmacology Cellular Biology A Multidisciplinary Science 生物化学实验 介绍生物化学实验的原理和方法 动手! 使用各种生物化学实验仪器，掌握生物化学的各种基本实验方法和操作技能 加深对生物化学理论知识的认识和理解。 What should we get 设计一个实验的基本思路，根据掌握的实验基本原理，严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间－－去解决所需要解决的问题。 生化实验四大 必杀技 离心 电泳 层析 光谱 What should we do 预习： 操作：安全什么是动手能力强？ 记录：Raw Data 总结： 实验记录 实验前预习，了解要学习的主要内容。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。 实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改 实验报告（A4大小纸，计算成绩！) 实验目的 实验原理 仪器、材料和试剂 实验步骤 结果讨论（含数理据处） 注意事项 成绩 考勤 课堂表现 实验报告 笔试 实际操作考试 实验一 氨基酸的分离鉴定 ——纸层析法 【实验目的】 学习氨基酸纸层析法的基本原理 掌握氨基酸纸层析的操作技术 纸层析法属于分配层析，它是以层析滤纸为载体，以吸附于滤纸纤维羟基上的一层水（极性）为固定相，流动相是有机溶剂，主要是正丁醇（非极性溶剂）。分离氨基酸是根据不同氨基酸的极性，在固定相和流动相中的分配系数不同而进行分离的（依据相似相溶原理）。 【实验原理】 分配层析: 利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法。 分配系数: 是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时，该溶质在两种溶剂中所具有浓度之比。不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同，因而也就有不同的分配系数。 。 氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值)来表示的。 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 【实验器材与试剂】 1、层析缸 2、毛细管 3、喉头喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸 6、铅笔（直尺） 7、分液漏斗 8、吹风机 9、 正丁醇 10、冰醋酸 11、氨基酸标准样品 12、氨基酸混合样品 13、0.1%水合茚三 酮正丁醇溶液 【实验步骤】 1、配扩展剂： 正丁醇：冰醋酸：水= 20ml ：5ml ：15ml 顺序：正丁醇→冰醋酸→水，放入分液漏斗中，充分混匀。静置约10min后分层，放出下层水层，其余的倒入培养皿中。 2. 准备滤纸 取一张层析滤纸，距纸底边2cm处用铅笔划一横线，沿线每隔2.5cm作一记号为点样处，点样处也不要太靠近两侧边（约距1.5cm），会产生边缘效应。  3.点样（顺纸纹方向）  用毛细管依次吸取标准品氨基酸和混合样，吸管与滤纸垂直，轻轻接触纸面，样品扩散直径小于3mm。一滴滴完后用冷风(低温）吹干，再点第二次，共点三次。 4.扩展 将点完样的滤纸两侧面对齐，用针线缝合，纸的两边不能接触。将点样后的滤纸直立于培养皿的扩展剂中，（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm ）当溶剂展层至滤纸上沿2cm处展层结束，取出滤纸。用铅笔画出展层前沿位置，在通风橱中用热风吹干。 5. 显色 用喉头喷雾器均匀喷上0.1％茚三酮正丁醇溶液，然后用热风吹干即可显出各层析斑点。 6. 测量、计算： 分别测量X、Y值，计算各氨基酸的Rf值。 Rf= X÷Y 注意事项 1、手尽量小心接触滤纸，顺纸纹方向层析。 2、吸取样品的毛细管不可混用。 3、点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距 离不能太近。 4、吹干时一定要保证完全吹干。 5、缝合时，滤纸的两个纸边不能相互接触并且底边应对齐，点样线一面滤纸朝外。 6、点样时，样