植物激素定量分析方法资料.ppt

植物激素定量分析方法研究进展 主讲：陈佰鸿 甘肃农业大学农学院果树科学系 2011年3月1日 1、植物激素的提取纯化与检测的步骤 首先, 在样品的收集过程中, 植物材料应迅速用液氮冷冻, 以保证所分析的样品最大限度保持植物的原始状态, 没有因为植物受伤而导致植物激素含量的失真, 并在液氮保护下研磨成粉末; 其次, 选择合适的提取溶剂对目标激素进行高效率的提取; 再次, 优化纯化方法, 对植物粗提物进行纯化和富集; 最后, 建立灵敏的测定方法, 对植物样品中的植物激素进行准确可靠的分析. 因此高选择性的样品提取纯化方法和高灵敏的测定技术的开发将是植物激素检测的研究重点. 1.1 提取方法 植物激素分析首要工作是从植物材料中将目标植物激素充分提取出来. 这取决于两个方面: 一是植物材料的处理, 通常选择液氮冷冻条件下的新鲜或冻干处理的植物材料进行充分研磨; 二是选择合适的提取方法将植物激素从这些材料中提取出来. 提取溶剂的选择主要取决于目标植物激素的物理化学性质和植物样品的性质, 并综合考虑提取过程中提取环境和植物激素在植物体内存在的形态等影响因素, 其基本原则是在不改变植物激素成分变化条件下, 最大限度地提取出目标植物激素并尽量降低干扰杂质的溶出. 目前, 溶剂提取法仍然是植物激素研究采用的最广泛的提取方法. 甲醇、丙酮、丙醇及其水溶液和中性、酸性缓冲溶液是较为常用的提取液, 有机溶剂与水的比例通常需要依据被检测植物激素的极性来确定, 极性很小的溶剂如乙醚通常不用来提取植物激素. 在这些有机溶剂体系中, 甲醇由于分子量小, 渗透性较强, 在提取过程中可以渗透到细胞中,一直是植物激素提取的首选溶剂, 被广泛地用于植物激素的提取. 在提取过程中, 部分植物激素化学性质不稳定, 容易受到提取环境的影响. 例如,生长素类植物激素容易氧化或见光分解, 在分析提取过程中一定要避免光照、高氧和高温等外部环境,因此需要在提取过程中加入抗坏血酸、铜试剂等电极电位较低的抗氧化剂, 保证其在提取过程中的稳定. 除了外部环境对部分目标植物激素稳定性的影响之外, 一些植物激素在提取过程中还会受到植物体内酶的影响. 例如, 在细胞分裂素的提取过程中, 植物体内的碱性磷酸酯酶会造成核苷酸型细胞分裂素的水解, 这种酶在80%甲醇提取液中仍保持一定活性,采用该溶剂体系会对分析结果产生不利影响, 改进的方法是使用Bieleski 试剂(MeOH:CHCl3:HCOOH:H2O=12:5:1:2, 体积比), 它能有效降低核苷酸型细胞分裂素酶解为核苷。 1.2 纯化方法 一般而言, 通过有机溶剂提取的植物粗提物中含有大量的植物次生代谢产物, 而植物激素在粗提物中含量极低, 这些植物次生代谢物会对植物激素的定量分析产生很强的干扰, 影响分析结果的准确性, 因此植物粗提物并不适合直接进行植物激素定量分析. 通过对植物粗提物进行一系列的后续处理,能够将感兴趣的目标植物激素进行纯化和富集, 降低或者消除植物组织中大量复杂的背景干扰, 从而使样品适合定量分析. 随着对植物激素研究工作的深入, 从经典的液相萃取到固相提取越来越多的新技术和新方法被引入到植物激素分析领域. (1) 液相萃取：液相萃取主要是利用目标化合物组分在互不相溶的溶剂体系中溶解度的不同而达到分离或纯化目的. 对于一些植物组织中含量相对较高的植物激素, 利用液相萃取法对植物提取物进行纯化处理, 也能得到较好的分析结果. (2) 固相萃取： 固相萃取(SPE)技术是一个包括液相和固相的物理萃取过程, 其主要目的是把痕量被测定组分进行浓缩和富集. 固相萃取柱用以保留目标化合物, 并尽量减少干扰杂质的保留, 选择合适的溶剂将干扰杂质淋洗掉, 然后再用另一溶剂把感兴趣的分析物从固定相上洗脱下来; 反之, 也可让目标化合物直接通过固定相而不被保留, 同时大部分干扰物质被保留在固定相上, 从而得到分离. 与传统的液相萃取技术相比, 固相萃取不需要大量互不相溶的有机溶剂, 可供选择的固定相种类较多, 具有快速、可靠、消耗试剂少、易于实现自动化等优点, 能够对复杂基质样品中的目标化合物进行纯化和富集,满足了人们对处理方法的高效、快捷、简单和低消耗的要求, 被广泛用于植物激素类样品的处理. 2 分析方法 建立植物组织中微量植物激素灵敏的测定方法,对于阐明植物激素在植物生长发育中的作用和功能具有十分重要的意义. 虽然植物提取物经过液液萃取、固相萃取等手段的富集和纯化, 但考虑到植物激素在植物体内含量极低、性质不稳定, 加上前处理并不能完全消除植物组织中复杂的基质干扰, 故植物激素的分析方法必须十分灵敏和专一, 才能对植物体内的植物激素进行准确的定量. 随着科技的发展和创新, 越来越