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血清成分分析 ——家鸡、乌鸡 实验材料 家鸡、乌鸡血清 血清指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。而胆固醇含量、血清清蛋白、γ-球蛋白、谷丙转氨酶都是血清中的主要成分，通过此次实验可知家鸡与乌鸡血清成分的差别，并掌握血清成分分析的方法。 实验一、血清胆固醇的定量测定 胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用。产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。100mL样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系。 表2 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线 表1 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线数据 结果分析： 理论值乌鸡胆固醇含量比家鸡低，而实验结果显示乌鸡含量比家鸡高。可能原因： ①由于实验时间长，鸡血在常温下放置时间过长，导致显色反应产生误差； ②可能是因为吸取家鸡和乌鸡血清时没有将血清充分摇匀，给实验造成了一定的误差； ③分光光度计不准确导致； ④这可能与个体差异有关； ⑤硫酸含量的高底也对显色有影响，故实验数据可能不是很精确。 实验二、血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定 1、血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩 醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。 实验结果： 结果分析： 全血清有四条带，清蛋白有一条带，γ-球蛋白实验失败。清蛋白跑的最远，依次是β-球蛋白，α-球蛋白，γ-球蛋白可能在点样时出现失误，电泳成团，或者样品制作时离心时间不够，γ-球蛋白未完全沉淀，导致扩散没有呈直线。 实验三、谷丙转氨酶活性的鉴定及活力的测定 实验结果： 结果分析： 谷氨酸和丙氨酸为一条带，测试管为两条带，对照管为一条带，煮沸液出现的一条带不够干净，可能原因是煮沸时间不够长，不够彻底，也可能是点样时出现失误。 2、血清谷丙转氨酶活力单位测定 用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数。 表4 酶活力标准曲线数据 表5 酶活力标准曲线数据 * 家鸡 乌鸡 血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定 血清胆固醇的定量测定 血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定 编号 0 1 2 3 4 100ml血清中总胆固醇含量/mg 0 100 200 300 400 吸光度A550nm/Abs 0.000 0.161 0.333 0.532 0.706 表3 乌鸡、家鸡胆固醇含量测定结果 对照组 乌鸡 家鸡 吸光度A550nm/Abs 0 0.070 0.053 100ml血清中总胆固醇含量/mg 0 48 30 盐析：高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀。 透析：利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。 浓缩：利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。 2、凝胶层析 当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。 当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。 实验结果： 以溶液体积为横坐标，溶液颜色深浅为纵坐标作出以上体积图。 3、血清清蛋白与γ-球蛋白的鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳发） 浸泡 点样 电泳 染色 漂洗 全血清蛋白 β-球蛋白，a-球蛋白 γ-球蛋白 1、谷丙转氨酶活性的鉴定 通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。 谷氨酸 煮沸液 酶液 丙氨酸 编号 0 1 2 3 4 5 GPT单位数 0 100 200 300 400 500 吸光值A520nm 0.00