革耳（Panus rudis）漆酶的异源表达和酶学性质改良.pdf

中文摘要 摘要 漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，它的合成分泌存在有一系列的转译后加工过 程(如糖基化等)，一般认为漆酶蛋白的异源表达是比较困难。另外，漆酶的某些性 质如氧化还原电位较低，高温易失活等也阻碍了它在实际中的应用。 野生革耳是新发现的一种能生产组成型漆酶的白腐真菌，该菌产生的漆酶具 有较好的热稳定性，是一种极具研究价值和开发潜力的真菌漆酶。本研究中首先 性影响的结果，当诱导培养温度为20℃，培养基中cus04浓度为03mM时漆酶 现LccT的最大酶活(192U／L)是Lcc的最大酶活(42．9u／L)的4．5倍。这～结果表 换层析得到电泳纯的漆酶蛋自LCCT，pH4．5时的比活力为3．68U／mg。根据 SDS．PAGE测定的重组漆酶LCcT的表观分子量为61．6 mmol／L， 的最适反应pH值为2．6，最适温度为45℃。氧化ABTs的K。值为O．61 保温1h保留酶活71％，50℃以下保温1h保留酶活均大于80％。 行改造。 到的重组漆酶突变体LCCTM459纯化后的比活力在pH4．5时为8．54U／mg。根据 SDS—PAGE测定的重组漆酶LCCT459表观分子量为61．5 得最适反应pH值为3．0，最适温度45℃。氧化ABTS的K。值为0．16mmol／L，V。。 04 为20 于50％，说明在50℃以下的温度重组漆酶LCcTM459的活性相对稳定， 中义摘要 利用易错PCR(error-prone 表达载体在酵母中表达。在平板上对活性进行筛选，分离到一株突变体以及有3 达产物LCcTE的比活力在pH4．5时为16．17 酶LCCTE的表观分子量分别为59．8 活均大于70％，说明在50℃以下的温度重组漆酶LccT的活性较稳定， 下降。 本研究尝试在原核表达系统中表达野生革耳漆酶基因，并对表达产物进行复 终浓度并在室温下孵育复性，获得有活性的漆酶。对在不同温度下获得的可溶漆 酶蛋白复性研究发现，在20℃下培养获得的可溶漆酶经过相同的孵育时削后的活 性较在37℃下培养获得的可溶性漆酶高；而在相同孵育时间内获得高活性复性产 物所需铜离子浓度各不相同。在同一培养温度下获得的可溶性漆酶在室温下随着 孵育时间的增加活性有下降的趋势。本工作是首次报道真菌来源的漆酶基因在大 肠杆菌中实现表达。 关键词：漆酶；改良；定点突变：易错PcR：毕赤酵母：原核表达； 英义摘要 andmodi矗cation Heterologousexpression oflaccasef}om尸d即“Jr“(Z担 Abstract Laccaseisa afldhas in enzyme multicoppe卜containingmanypotential are t0 in inanactive i11dustry．Butmey difficulty generally expressionnonfungalsystem fonn．becauseaseriesof mod讯cationssuchas exiStin poSt_tra工1slational glycosylation and secretion．Atthesametimelaccaseshavesome1imitedcharacterssuch synthesis as 10wfeduction and1ess-thernlostable．