白念珠菌磷脂酶和对氟康唑耐药关系的实验的研究.pdfVIP

山东人学博Ij学{讧论义 白念珠菌磷脂酶与对氟康唑耐药关系的实验研究 研究生苏英 导 师李春阳 中文摘要 白念珠菌是人类最常见的条件致病性真菌，亦是院内感染的主要病原 菌。目前，念珠菌感染性疾病呈同趋增高趋势，且念珠菌血症的病死率居 高不下，深部白念珠菌感染病死率可高达67．9％，白念珠菌感染己成为院 内感染特别是免疫缺陷病患者最主要死因之一。随着抗真菌药物的大量应 用，真菌耐药的情况变得越来越严重，特别是对常用唑类药物的耐药，有 研究显示15．5％乃至更高的白念珠菌对氟康哗耐药，这给有效控制同益增高 的念珠菌感染带来严峻挑战。 白念珠菌耐药与其毒力因子之间存在重要关系，耐药株通常较敏感株毒 力强。研究发现耐药基因CDRl断裂突变的白念珠菌毒力明显下降，毒力增 强的耐药菌株可有耐药基因CDR和MDR的过度表达。且念珠菌菌丝相形成 能力和耐药之间存在一种正相关关系。随着白念珠菌对氟康唑耐药性的出 现，其分泌蛋白酶和磷脂酶等毒力因子的能力亦同时增加。因此研究白念 珠菌毒力因子与耐药发生间的关系，降低念珠菌毒力与致病性，防止念珠 菌耐药的发生，最终有效控制念珠菌感染是21世纪面临的重大科研任务。 念珠菌致病性与其毒力因子密切相关，念珠菌通过黏附来识别宿主， 通过其利于侵入的酶增强毒力，通过形态发生及酵母相与菌丝相之间的转 换使其利于侵入宿主，并对该微生物的适应性有利。因此，念珠菌毒力因 子包括黏附素、利于侵入的酶、形态发生及表型转换等。其中细胞外磷脂 酶是念珠菌入侵组织的重要毒力因子，它作用于分子中不同酯健，使甘油 磷脂形成溶血磷脂从而引起组织细胞损伤。磷脂酶包括A、B、C、D四种类 型，磷脂酶A有促进白念珠菌引发炎症的作用，磷脂酶C和D与白念珠菌 表型转换和信息传递有关，磷脂酶B主要通过分解宿主细胞膜磷脂而引起 LiJ尔人学}14；学化葩文 膜的通透性增高和完整性受损，继而促进白念珠菌的早期入侵。磷脂酶B 又分为磷脂酶Bl和磷脂酶B2，磷脂酶Bl是一种分泌型糖蛋白，分子量为 84KD，由605个氨基酸组成，它同时具有水解酶和溶血磷脂转酰酶的活性， 研究发现一个PLBl基因敲除的白念珠菌菌株在体外产生的磷脂酶减少且致 病性降低，PLBl是念珠菌致病所必需的毒力因子。 畔类抗真菌药物主要通过抑制14a．去甲基化酶活性作用影响14u去甲基 化，从而使麦角固醇的合成受阻，导致真菌细胞膜的完整性受损而发挥抗 真菌作用。患者的细胞免疫功能缺陷，药物的反复应用，机体的感染状况 及可能存在的耐药遗传性等相关因素均可诱导耐药的发生。畔类的酬‘药机 制主要包括药物流出泵的过度表达，药物靶酶的突变和过度表达，生物被 膜的形成及念珠菌细胞内滤泡对药物分子的扣押机制等。但亦有研究发现 有些MIC值较高的菌株，毒力因子的活性却降低。毒力高的菌株所致感染 易于控制，而毒力低的菌株对FCZ的治疗出现耐药。念珠菌耐药与其毒力 因子间存在复杂的相互关系， 目前，有关念珠菌磷脂酶与耐药发生关系的研究报道国内外并不多见， 国内报道通过诱导使白念珠菌耐药，进而研究比较耐药菌株、诱导耐药菌 株、敏感菌株磷脂酶、蛋白酶活性及致病性强弱的报道。而从分子水平研 究磷脂酶B与耐药的关系目前还是空白。本研究拟通过M27一A方案筛选白 念珠菌耐药菌株和敏感菌株，研究其磷脂酶活性和致病性的不同，并进一 步研究两组磷脂酶B1的mRNA和蛋白表达的不同，为磷脂酶在耐药发生中 的作用提供研究基础，以期最终能够有效控制念珠菌耐药和感染的发生。 目的： 1．通过蛋黄平板法研究白念珠菌耐药菌株和敏感菌株磷脂酶活性的差 异。 2．通过动物毒力试验比较白念珠菌耐药菌株和敏感菌株致病性的强弱。 3．通过RT-PCR比较研究两组间磷脂酶B1转录水平mRNA表达的差异。 4．通过Westernblot法比较研究两组间磷脂酶B1蛋白表达水平的差异。 2 Ij J东人学flIi I“学f讧论文 方法：