固定化酶课件摘要.pptVIP

一、什么是固定化酶？ 二、固定化酶的特点 优点： 不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可装塔连续化生产； 稳定性好。 缺点： -固定化过程中往往会引起酶的失活 -首次投入成本高 -大分子底物较困难 （一） 吸附法 （二） 结合法 （三） 交联法 （四） 包埋法 （一） 吸附法 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。 选择载体的原则: - 要有巨大的比表面积 - 要有活泼的表面 - 便于装柱进行连续反应 物理吸附法: -静止法 -电沉积法 -反应器上直接吸附法 -混合浴或振荡浴吸附法 （二）结合法 1 离子键结合法 2 共价键结合法 1 离子键结合法 酶分子 含有离子交换基团的固相载体 第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶 常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度 2 共价键结合法 （1）概念 （2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 （3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体 共价键结合法制备固定化酶的“通式” 首先载体上引进活泼基团 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键 （4）载体活化的方法 A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法 （三）交联法 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用试剂:戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛。 交联法有2种形式： 酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。 酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。 双重固定法：（1） 吸附交联法 先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。 （2）交联包埋法 把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。 （四） 包埋法（entrapping method） 定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中使酶固定化的方法。 1．网格型 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶的方法。也称为凝胶包埋法。 2．微囊型包埋法 将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 各类固定化方法的特点比较: 固定化后酶的考察项目： （1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。 （2） 考察固定化酶稳定性。 （3） 考察固定化酶最适反应条件。 评价固定化酶的指标: 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2） 3. 4. 或称偶联效率，活力保留百分数。 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。 四、影响固定化酶性质的因素 1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 2．载体的影响 （1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应 3. 固定化方法的影响 五、固定化后酶性质的变化 1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降 原因：酶结构的变化 空间位阻 2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高。 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 （3） 对热稳定性，大多数升高，有些 反而降低。 （4）