基因组序列诠释课件摘要.ppt

* Digest the double stranded cDNA with a sequence-specific restriction enzyme (an anchoring enzyme) that cleaves most transcripts at least once. Nla III is used as an anchoring enzyme since Nla III sites are known to occur approximately every 250 bp. 5. Cleave with Mme I, a Type IIS restriction enzyme (tagging enzyme). Mme I binds to a recognition sequence in the adapter adjacent to the CATG site and cleaves the cDNA ～21 bp downstream from the adapter, releasing a ~60-bp tag with a 2-bp overhang. The tag consists of ~40 bp of adapter sequence and ～21 bp of unique sequence from a single transcript. 第二讲 基因组序列诠释 5. 转录物组 6. 蛋白质组 问题 细胞周期的不同时期 个体发育不同阶段 不同的器官和组织 不同的外界环境下 各种基因的表达与否、量的差异、表达部位如何 5. 转录物组 5.1 Northern杂交 杂交主要步骤： 提取总RNA（不同组织、不同器官） ↓ 变性电泳 ↓ 制备目的基因探针 转移尼龙膜 （放射性 或 化学标记法） 杂 交 ↓ 扫描或放射自显影 ↓ 依据杂交信号的强弱、有无判断基因的表达部位、 表达量、表达时期等 5.2 SAGE SAGE （serials analysis of gene expression） 基因表达系列分析 1995 Velculescu 及其同事年创立 1. 将5μg含有oligo dT（引物）的磁珠与RNA混合。 2. 合成双链cDNA。? 3. 用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签的产物。? 4. 将样品分成两份，连接成含有识别序列的产物，以备用BsmF1消化。 5. 用Mme I切割每一个样品形成约60bp的标签。 SAGE 步骤 6. 延伸5秒，连接成约130bp的双链标签。? 7. PCR扩增。 8. 用Nla Ⅲ酶切130bp产物释放34bp双链标签。 9. 连接片断形成串联体。? 10. 克隆到pZErO-1+里，并测序。? SAGE实例 SAGE特点： 进行转录物组研究，也就是转录水平的研究； 通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息； SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息，这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策略； SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速； SAGE 技术的主要理论依据： 来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的标签（tag）； 通过简单的方法将这