近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）（R）-专一性羰基还原酶基因的克隆与表达.pdfVIP

摘要 光学纯苯基乙二醇是液晶材料中重要手性添加剂和医药、农药及精细化工产品的重要 手性中间体。本实验室已通过筛选得到一株可立体选择性转化外消旋体得到(s)一苯基乙二 醇的菌株，近平滑假丝酵母(chH击出脚嘲芦ffos回ccTccM203011，并通过纯化得到催化 carbonylreductaSe，rcR)纯蛋白，本实验的目的 其反应的俾)·专一性羰基还原酶(∞)一specific 就是在分子水平上对羰基还原酶基因(r们进行研究，为得到更高效的专一性酶类打下基础。 首先以近平滑假丝酵母CCTCC M203011基因组为模板，以rcR蛋白测序结果为依据 设计引物，PCR扩增得到r盯全基因片断，将M连接入pMDl8一Tvector得到测序质粒 Zinc 计算分子量为35．9kD。通过对r盯基因的序列分析，鉴定了其3个功能域，分别为Adh 锌离子结合域，NAD+Binding辅酶结合域以及GroEslike折叠腔域，此结果与纯蛋白性 质相符合：并构建，仃基因的系统进化树。 构建表达质粒plk．疋R，并酶切检验；将pnc一圮R转化大肠杆菌表达菌株，得到含 目的基因的重组大肠杆菌EcD，f 分析得到重组蛋白表达条带；酶的活力测定显示Eco，f (97．5％e．e．，28％yield)。 通过摇瓶条件的研究，确定了重组蛋白的最佳诱导条件为：250mL的三角瓶中装液量 结束培养。 以重组菌全细胞催化不对称还原反应，确定了重组菌的最佳反应条件为：最适反应 底物浓度2‰；在反应体系中添加O．5％乙醇对反应有很大的促进作用，产物(尺)一苯基乙二 醇的e．e．值98％，得率80％。 关键词：克隆：表达；羰基还原酶；不对称还原；僻)一苯基乙二醇 Abstract actiVe averSatileaschiral for山e O面cally 1一phenyl一1，2一etllalledi01isgroup buiIdingblock of the synmeses ph锄aceutjcals，agrochelllicals，phemmones，aIld1iquidcryst舡s，etc．InIab， M203011waSscreenedfor廿1e conversionofmcemic Ch，?西如眇d瑚f，∞捃CCTCC aSymme翻c the 1一l，2·e也anedi01．nen 1一phenyl—l，2一e也anediolto(IS)一1一pheny p面五ed∽)一specmccarbonyl whichworked．m也e conversionwas of reductase(rcR)pro惦in aSymmemc rcsearch ttlis was and beabaSicto the gailledstIldy也e圮r more gene，and get e街ciency en巧me． The whichencodes M203011waScloned． gene rCR台om＆n威如p口r口瑚ffos捃CCTCC Thenme waS PCR