不同亚型重组人白细胞介素8蛋白表达、纯化与活性检测.pdf

2．1．2工具酶与试剂………………………………………………………………··21 2．1．3主要仪器设备…………………………………………………………………·．21 2．2实验方法………………………………………………………………………………22 2．2．1引物设计………………………………………………………………………．．22 2．2．2真核表达载体构建……………………………………………………………．23 2．2．3不同亚型的重组人IL．8蛋白活性测定…………………………………24 2．3实验结果与讨论………………………………………………………………………25 2．3．1 Split．TEVGPCR测活检测系统原理…………………………………………25 2．3．2 GPCR测活检测系统真核表达载体的构建………………·28 Split—TEV 2．3．3转染与生物学活性检测………………………………………………………．．30 2，4结论…………………………………………………………………………………．．32 参考文献…………………………………·：……………………………………………．．33 综j苤………………………………………………………………………………………．35 致谢………………………………………………………………………………………．45 万方数据 摘要 化因子CXC亚家族的一员，是体内炎症反应应答的主要介质之一。除常规生化检 测方法之外，尚未有报道利用蛋白质片段互补检测(Protein Fragment ComplementationAssay，PCA)技术对IL．8的生物学活性进行测定。本文利用基因工 程技术实现重组人源性IL．8的高效表达、纯化，并利用PCA技术实现重组IL．8活 性检测。方法：将3种不同亚型的重组人IL、8基因片段分别与表达载体pME．15．6His 和pET-32a连接，转入哺乳动物细胞HEK 的表达。采用IMAC亲和层析柱对重组人IL．8进行纯化。根据PCA技术，构建了 GPCR激活检测系统，对纯化的目的蛋白进行了细胞内生物学活性检测。 Split．TEV form I，前体IL一8基因在HEK 结果：成功构建了真核表达载体pME一15-6His／IL．8 293F中正确分泌表达，其N端信号肽(残基1．20)被切除，经过纯化得到的重组 form form 蛋白为成熟的IL．8 I(残基21—99)；成功构建了原核表达载体pET-32a／IL．8 form III，N端融合了Trx标签的重组蛋白在大肠杆菌中正确表达， II和pET-32a／IL．8 form 经过纯化和重组肠激酶酶切得到的重组蛋白为IL．8 II(残基23．99)和IL．8 form I)、15。14 活性，其EC50值分别为：12．32ng／ml(Formng／ml(FormII)和2。85ng／ml (Form III)。结论：成功构建、表达和纯化了具有生物学活性的3种不同亚型的重 组人IL一8，为进一步的理论研究和大批量生产奠定了基础。 关键词白细胞介素一8 哺乳动物细胞 活性检测 蛋白质片段互补 Split-TEV 中图分类号Q786 万方数据