人溶血磷脂酸受体1基因的克隆、表达载体构建及其瞬时转染293T细胞.pdfVIP

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2016-05-13 发布于安徽
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人溶血磷脂酸受体1基因的克隆、表达载体构建及其瞬时转染293T细胞.pdf

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生物技术通报 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年第期 2013 8 人溶血磷脂酸受体 1 基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染 293T 细胞李铁威赵鹏飞马洁阿拉坦高勒（内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021）摘要：从人胃癌细胞中提取RNA 然后反转录成cDNA ，进而PCR 克隆LPAR1 （Lysophosphatidic Acid Receptor 1 ）基因，亚克隆到pCR2.1 载体，通过测序、酶切、连接到表达载体pIRES2-EGFP ，通过酶切、测序鉴定获得pIRES2-EGFP-LPAR1 重组质粒；表达载体以Lipofectamine2000 介导转染293T 细胞。用Real-time PCR 法检测外源基因在293T 细胞中表达，并通过ELISA 检测 LPAR1 的活性。结果表明，克隆到LPAR1 基因并获得了pIRES2-EGFP-LPAR1 表达载体，在293T 细胞中确认到LPAR1 基因的过量表达，并通过LPAR1/Gi 信号通路抑制cAMP 形成加以验证所克隆LPAR1 活性。过表达细胞模型的建立，不仅为下一步 LPAR1 对该受体功能研究奠定了基础，还使利用LPA 剂量依赖性的抑制cAMP 的线性关系定量LPA 的细胞学方法成为可能。关键词： LPAR1 基因克隆转基因细胞模型 cAMP 应答 Cloning and Construction of Expression Vector of Human Lysophosphatidic Acid Receptor LPAR1 and Its Transient Transfection into 293T Cell Li Tiewei Zhao Pengfei Ma Jie Alatan Gaole （，， 0 10021 ） College of Life Sciences Inner Mongolia University Huhhot Abstract: To detect the over-expression of LPAR1 and the accumulation of cAMP in transfected 293T cells, human LPAR1 gene was cloned and the LPAR1 expressing vector was constructed. LPAR1 CDS sequence was cloned from human gastric cancer cells and sub-cloned into the pCR2.1 vector. By sequencing, digestion and ligation, LPAR1 was directio