虎流感病毒的分离、鉴定和基因检测.pdfVIP

史鱼查堕量堡堂垒生塑型曼堂坌盒筮丑选堂查型塑玺 ·337· 虎流感病毒的分离、鉴定和基因检测+ 夏成柱1，高玉伟1，扈荣良1，王立刚2，刘丹2，邹啸环3，黄 耕，，贺文琦 (1．军需大学军事兽医研究所长黑龙江省东北虎林圊， 哈尔滨150027；3军需大学中心实验室，长春130062) [摘 要] 应用F81猫肾传代细胞，从高热、拒食和间有神经症状的死亡虎病料中分离获得1株 病毒，经形态学、理化学、生物学和血清学系统鉴定，证明为1株流感病毒。采用流感病毒核蛋白基 因引物，对分离病毒及该虎病料进行RT--PCR扩增和序列分析，结果从分离病毒和虎病料ee均扩 增出与理论值大小相符的464bp基因片段，其序列与A、B、C三型流感病毒相比较，同源性分别为： 段，氨基酸序列推导结果表明该病毒HA裂解位点区由6个碱性氨基酸组成，符合高致病力流感病 毒的特征。用此分离病毒静脉接种3月龄家猫3只，出现与病虎相似的临床症状，1只耐过，2只死 亡，剖检变化与死虎相似，主要呈现肺炎病变，并可从病料中回收到所接种病毒。另以此分离病毒为 HA抗原，进行虎与猫血清的HI抗体检测，结果康复虎血清比其病初血清、康复猫血清比其接种前 血清HI抗体均有4倍以上增高，表明该病毒具有致病性，是引起该虎与实验猫发病甚至死亡的病 原。从大型猫科动物虎中发现流感并从中分离获得A型流感病毒，在国内外均属首次。 [关键词]流感病毒；基因；分离；鉴定；虎 定期地暴发流行。1 多口]。在美国，每年因流感导致的死亡人数近两万人，超过车祸和艾滋病造成的死亡人数o]。动物的流感已在 猪、马、禽与海洋哺乳动物中发现o]，其中尤以禽流感的危害最大，常给养禽业带来毁灭性的打击。特别是 1 在世界各地建立了众多流感监测网络，在全球范围内对流感进行监测和研究，密切监视流感流行与变异的新 动向，搜集对人类健康有潜在影响的动物流感病毒，并进行其在同种和不同种宿主间传播致病的分子机制和 变异规律的研究，预测可能出现的新的变异株，以提前做好对本病的预防和扑灭准备”]。 病，病死率近40％，剖检主要为肺炎变化。经病毒分离、动物接种和基因检测，确定为A型动物流感病毒感 染，现报告如下。 1材料与方法 1．1细胞与培养F81、DK和Vero细胞引自中国兽医药品监察所。按常规传代培养。 滤膜过滤除菌，置一30℃待分离。 1．3细菌分离无菌取病虎心血接种兔血琼脂培养基和小鼠进行李氏杆菌等细菌及弓浆虫的分离。 ·通讯作者 夏咸柱(1939～)，军需大学研究员，博士生导师 联系电话：0431—7983154 ot9th ‘338’Proceedings 1·4病毒分离与纯化采用单层吸附接毒法，待Fst细胞长成单层后，倾弃生长液，接人除菌待分离的虎肺 待纯化，传至第5代仍无病变判为分离阴性，结束分离。 z～ 病毒纯化采用终点稀释法，如同病毒TCID。。测定，用微量细胞培养板进行，即将待纯化病毒作10 102连续稀释，接种Fs，细胞，每个稀释度病毒液接种4孔，以培养液上清出现1；2以上HA效价为阳性感 染，出现阳性感染的样品最高稀释度孔内病毒培养物即为纯化病毒，按病毒命名原则命名为A／虎／哈尔滨 (中国)／01／2002，用F8-细胞增殖分装小瓶，置一70℃待鉴定。 1．5形态学鉴定取待鉴定的纯化病毒接种Fst细胞于37℃培养，待出现典型细胞病变后，取上清作电镜 负染色观察和取细胞成份作电镜超薄切片观察，照相。 1．6 理化特性鉴定 5、 对照组低2I．ogl0以上判定为敏感。核酸型的鉴定也采用文献“3报道的方法：在换液的同时于24孔板的每个 ～10_1 2)，同时设对照组，以试验组较对照组低2L0910以上判定为敏感。 1．7生物学特性鉴定 1．7．1血凝特性试验按文献[61的方法检测纯化病毒对鸡、猪、人、豚鼠与犬的红细胞的凝集