第三章毛细管电泳法要点.ppt

3.缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好； 4.检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化； 类型 检测限/mol 特点 紫外-可见 10-13～10-15 加二极管阵列，光谱信息 荧光 10-15～10-17 灵敏度高，样品需衍生 激光诱导荧光 10-18～10-20 灵敏度极高，样品需衍生 电导 10-18～10-19 离子灵敏，需专用的装置； 二、毛细管电泳的进样方式 进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小； 1.流体力学进样方式 （1）进样端加压 （2）出口端抽真空 （3）虹吸进样 毛细管一端插入样品瓶，加电压； 2.电动进样方式 进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大； 离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去； 特别适合黏度大的试样。 3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。 第四节 毛细管电泳类型 常用的六种电泳分离模式； 根据试样性质不同，采用不同的分离类型； 每种机理的选择性不同； 一、毛细管区带电泳（Capillary zone electrophoresis , CZE） 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流 ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。 CZE是最基本、应用广的分离模式； 二、毛细管凝胶电泳 Capillary gel electrophoresis ，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。 1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 三、 胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）Micellar electrokinetic capillary chromatography, MEKC 在电场力的作用下，胶束在柱中移动。 2. 电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流 ν电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动； 5.色谱与电泳分离模式的结合。 3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围； 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8.0 kV）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零； 四、毛细管等电聚焦Capillary isoelectric focusing, CIEF 4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离； 5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液； 6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测； 7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。 1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。 2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。 五、毛细管等速电泳 Capillary isotachophoresis ，CITP 3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(ν=μE)，淌度大的离子区带电场强度小。 沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4? ? ? ?电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区