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Western实验步骤及注意事项
Western实验步骤
点击次数: 1275 作者:ab-mart 发表于:2009-05-22 17:50 转载请注明来自丁香园
来源:ab-mart
一、样品制备
对于Western Blotting实验而言,样品处理是关键步骤之一,获得的蛋白样品必须均质、可溶,并解离成单个多肽亚基,且尽量减少相互间的聚集,使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时,需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器(如核抽提物),或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。
1. 样品收集
1)培养的细胞
贴壁和悬浮细胞收集方式不同,细胞裂解液种类各异,推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解,煮沸即可。
2)动物组织
与细胞不同,组织块由于体积较大,须预先经破碎匀浆处理。
2. 样品定量
样品电泳前需测定蛋白浓度,以便保证上样量一致,有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种,其灵敏度和所需时间不同,且不同的方法会受不同干扰物质的影响,实验者可根据样品制备方法(裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等)自行选择。
几种蛋白质浓度测定方法比较
优点 缺点 Bradford法 迅速、灵敏 对各种纯化蛋白质反应不同 BCA法 简单、干扰少 耗时 Lowry法 不同蛋白差别小 干扰多,较慢
注意事项:
a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白(如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等)及其他干扰物质;
b. 样品浓度应适中,1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量:贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml,悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入;
c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要,浓度应控制在2-10%之间,并根据具体需要调整;
d. 制备好的样品可以在-20℃保存,但时间不宜过长,并避免反复冻融,否则蛋白会发生降解;
e. 内参对实验结果至关重要,应选择合适的内参。
二、电泳
电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳,Western Blotting中常用的是不连续缓冲系统下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS),该法中由于变性的多肽与SDS结合而带负电荷,在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的分子量相关。凝胶的筛分特性取决于它的孔径,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
丙烯酰胺浓度(%) 线性分离范围(KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212
注意事项:
a. 根据目标蛋白的分子量选择合适浓度的凝胶,以达到最优的分离效果和分辨率;
b. 分离胶不宜灌注过满,需要有一定的浓缩胶空间,否则起不到浓缩效果;
c. 各泳道上样体积最好大体一致且适中,体积偏差过大会相互挤压导致条带走形,为避免边缘效应,可在未加样的泳道加入等量的样品缓冲液;
d. 电泳时应保持电压和电流稳定,且不宜过高,否则会造成不规则的蛋白质迁移带;
e. 如有特殊需要,可以使用梯度胶,高浓度丙烯酰胺可以使低分子量蛋白质形成清晰的条带,还能在一块胶内同时分离分子量范围更大的蛋白质。
三、转膜
蛋白质经SDS分离后,必须及时从凝胶中转移到固相支持物上,固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性,而且支持物本身还有免疫反应惰性,这使其比直接在凝胶上检测更易操作,试剂用量更少,更省时,效果更好。
蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法,分为半干式和湿式转印两种模式,与SDS结合的蛋白由于带有负电,在电场中向正极迁移,并最终结合在固相支持物上。两种方法均卓有成效,且各有所长,实验者可根据实验情况不同进行选择。
常用固相支持物
硝酸纤维素(NC)膜 尼龙膜 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 较高 低 能力 80-110 ug/cm2 400 ug/cm2 125-200 ug/cm2(适合于SDS存在下与蛋白质的结合) 材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有 操作程序 缓冲液润湿,避免气泡 缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿 检测方式 常规染色,可用于放射性和非放射性检测 不能用阴离子染料 常规染色,可用考马斯亮蓝染色,可用于ECL检测,快速免疫检测 适用范围 0.45um: 一般蛋白0.2um: 20kD蛋白0.1um:7kD蛋白 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中) 糖蛋白检测和蛋白质测序 价格 较便宜 便宜 较贵
注意事项
a. 样品属性、膜类型、胶浓度以及转移缓冲液均会影响蛋白质的转移效率,比如小分子量蛋白与大分子量蛋白相比,迁移迅速,但结合不牢固;
b. 蛋白与固相支持物结合的程度受多种因素影响,如膜属性
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