农杆菌介导的粳稻遗传物质转化体系的建立….docx

农杆菌介导的粳稻遗传物质转化体系的建立 1：研究的目的和意义 籼稻是我国最大的栽培稻类型，栽培面积约占全国水稻面积的 74％[1]。籼稻离体培养的愈伤组织诱导及植株再生比较困难，且品种特异性明显，严重地影响了籼稻转基因工作的开展。筛选适于遗传转化的籼稻受体品种，建立高效、规模化的籼稻遗传转化平台，同时针对目前基因功能研究及生产上普遍应用但较难转化的籼稻基因型，有目的、有针对性的建立一套转化效率高、重复性好、简单快捷的籼稻转化体系，已成为当前籼稻转基因育种及基因功能研究的首要任务。 我国地域辽阔，海岸线长，既有大量的滨海盐碱地，又有内陆盐碱地[2]，中国盐碱土地约为2 000 万hm2 ，其中江苏滨海滩涂地约为60 多万hm2，其中只有少部分改良利用，绝大部分仍未脱盐及不断遭受盐渍危害。在影响农作物产量的各种因素中，干旱和盐碱所造成的减产达40%[3]。 HALI基因是酿酒酵母中的重要耐盐因子，其表达参与调节细胞内离子浓度，尽管HALI基因本身不是转运蛋白，但在盐胁迫下能与ENAI基因协同作用促进Na+外排，与其它转运系统协同作用增加K+的吸收，保持细胞内低的Na+/K+比，以减轻Na+毒害，因而在植物耐盐基因工程上具有很大的潜力，利用HALI基因转化粳稻在提高粳稻耐盐特性上有重要的理论和实践意义[4]。 基因工程技术的使用，一方面，可以将水稻基因中不具有的基因，如抗除草剂、抗病虫、耐盐碱、提高水稻品质及产量的基因导入水稻中，获得单靠传统育种方法无法实现的遗传重组，丰富水稻种质资源，提高育种效率[5]。另一方面，可以同时采用传统育种方法，如回交、转育等方法，来充分利用已获得的转基因材料，将目的基因导入难以转化的水稻品种中。 本研究通过对粳稻胚培养、花药培养的研究，建立了水稻离体再生技术体系，为粳稻遗传转化研究奠定了基础。通过对HALI基因农杆菌法转化水稻的研究，初步建立了粳稻农杆菌介导法基因转化体系，加快了现代生物技术在育种中的应用，提升了粳稻育种和研究水平。通过本研究，以期获得转HALI基因的转化植株，创造新的耐盐材料，提高粳稻的耐盐性。 2:国内外研究的动态 目前，国内外学者普遍重视水稻农杆菌介导转化技术，农杆菌介导的水稻遗传转化方法已达到了应用的阶段,逐步成为水稻转化的主流技术，国内外不少实验室己建立了较成熟的农杆菌介导转化体系，这一方法将进一步朝着高效规模化方向发展[6]。 2.1：水稻转化受体的研究进展 基因转化的成功在于建立良好的受体系统。作为转化受体系统应具备如下条件：（1)高效稳定的再生能力；（2)能接受外源DNA整合，具有较好的遗传稳定性；(3)具有稳定的外植体来源；（4)对选择性抗生素敏感；（5)对农杆菌侵染的敏感性。目前，用于水稻遗传转化的受体系统有以下几种：原生质体再生系统、愈伤组织载体系统、组织器官再生系统。 2.2：水稻转基因方法的研究进展 基因转化的方法可分为两类：一类是直接的基因转化，即将裸露的DNA直接转入植物细胞或原生质体，由此获得转基因植株的方法。包括基因枪法、原生质体法、电激法、PEG法、脂质体转化法、花粉管通道法等，其中基因枪法是目前较为常用的方法。另一类是由载体介导的转化，即利用另一种生物来实现基因的转入和整合，主要有农杆菌介导法和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛用于水稻转基因研究。PEG介导基因转化是利用高浓度PEG极强的亲水性，使DNA大分子沉淀，促进水稻原生质体和外缘DNA彼此靠拢聚合，因而使水稻原生质体直接摄取外缘DNA的方法。人们利用此法已获得了水稻转基因植株[7]。 农杆菌介导的籼稻遗传转化研究始于1992年，Chan 等［8］首次尝试以籼稻Taichung Native1的幼根为受体材料，得到转化的愈伤组织，经Southern 分析和酶活检测证明嵌合基因已经整合到愈伤组织中，但未获得再生植株。1994 年，Hiei等［9］采用“双超元”载体和向侵染液中添加乙酰丁香酮等改进措施建立了粳稻的高频农杆菌转化体系，带动了籼稻遗传转化技术的研究。在此基础上，相继在Pusa Basmati I、IR 系列品种、孟加拉籼稻种质及中国不同区域籼稻品种等基因型上获得成功[10]。。随后，研究重点从基因型依赖性弱、易转化类型的籼稻品种［11］转向基因型依赖性强、顽拗型籼稻品种转化体系的建立和优化。Hiei 和Komari［12］将侵染后由一个幼胚来源的愈伤组织分割成多个独立的转化个体，大大提高了转化率，并提出了一套适合纯籼型IR24、IR64、IR72 的转化程序。之后，他们又根据同工酶多态性将籼稻品种分为偏籼型，籼型，和纯籼型，提出基于成熟胚和幼胚为起始材料的适宜不同籼稻类型的一套转化技术流程［13］，但是，利用这套流程成功的报道并不