胶质细胞源性神经营养因子受体alpha1结构和功能关系的探讨.pdf

y618062 中文摘耍 胶质细胞源性神经营养因子受体 alphal结构与功能关系的探讨 摘 要 胺质知胞源性神经营养固子(GDNF)对多巴胺能神经元、运动神经元，感觉 神经元和肠道神经元荨多种神经元具有促进存活及保护作用；促进肾脏的发育 和精原细胞的成熟。因此，其极有希望被用于治疗神经损伤和神经系统退行性 病变等疾病。GDNF的神经蕾养作用主要是通过两类受体亚基介导·即胶质细 胞源性神经营养园子受体alpha(GFRcts)亚基和受体酪氪酸激酶RET亚基。 GFRas亚基是靠其(二．束端的磷酯酰肌醇键(GPI)锚定在细胞膜外表面曲鹿外 蛋白，它不能直接转导信号。传统观点认为，GDNF首先与GFRal结合形成 GDNF-GFRal复合物，此复合物再与RET结合彤成三聚体复合物，并引起 RET的二聚化和酪氨醺残基自磷酸化，从而引起下游的信号转导。后来的研究 发现，在某些细胞上，不需GDNF刺激，GFRal与RET即有辅结台。RET可增 学效应的位点目前已研究得比较清楚。但关于GFRetl分手的结构与功能的关 系目前尚未见报道。如果能阐明GFRal分子结构与功能关系，可以潭八认识 GDNF神经营养作用曲舟子机制，为设计具有神经营养作用的小分子多肤提供 靶标；也可以促进GDNF治疗帕金森病等神经退行性疾病的研究进程。 肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PCI2)是被广泛用于研究神经营养因子作用的细 胞模型。不同的神经营养园子可引起PCI2细胞增值或分化的不同袁型变化。 本研究采用RT-PCR、重组DNA技术，构建大鼠GFRal表达质粒，在大肠 杆菌中实现大鼠GFRal的高效表达，并通过金属螯静层析技术纯化重组蛋白。 然后，通过进化踪迹分析、同源序列联配及计算机软件模拟GFRal的二缎结构， 计算靓基酸残基的保守性、亲麓水性和溶剂可及面积，选定缺失突变曲区域。利 过观察GDNF对PCI2各突交体基因工程细胞株存活和分化影响并结合West— ern-blot检测彗果，确定GFRat中与GDNF结台并产生生绚学功能的重要功能 区域。本研究主要结果如下： 中文摘要 1．GFRal基因的克隆、表达及活性蛋白的获得 从新生4d eDNA。将GFRal Ni2十一NTA树脂纯化并在Ni”一柱上复性后，纯度达90％以上。 2．GDNF的表达及其对PCI2基因工程细胞的影响 Ni2+-NTA柱上进行纯化，稀释复性后，纯度达90％以上。利用细胞转染技术， 用GDNF分别刺激工程细胞，3天后观察其存活和分化情况。纯化和复性后的 3．GDNF家族及其受体GFRas家族的进化踪迹 用进化踪迹分析方法，对GDNF家族及其受体GFR家族进行进化分析； GFRas的二级结构及其残基的溶剂可及性，从而绘出了GFRas二级结构模式 图，并进一步确定突变区域和突变位点。 4．GFRal结构与功能分析 分别进行了N一端、c_端、C_端螺旋和中央区的缺失突变。在大肠杆菌中分别表 达这四个突变体。利用PCI2细胞的存活和分化情况，分别观察这四个突变体 对介导GDNF神经营养作用的影响。结果发现GFRalN一端对介导GDNF的 营养作用不重要；C-端靠近中央区的螺旋对介导GDNF的营养作用则是必需 的；中央区对介导GDNF的神经营养作用非常重要。 关键词胶质细胞源性神经营养因子；胶质细胞源性神经营养因子受体 Ⅱ1；RET酪氨酸激酶；PCI2细胞；结构与功能 研究生：陈雪红(病理生理学) 导师：崔瑞耀 英文摘要 RESERCHONTHE OFGLIALCELL—LINE—DERIVED PHICFACTORRECEPTORALPHA ABSTRACT Glialcellline—derived factor(GDNF)wasisolatedbasedonits